昆明小鼠胚胎干细胞分离培养及其向原始生殖细胞诱导分化的研究

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1、河南农业大学硕士学位论文昆明小鼠胚胎干细胞分离培养及其向原始生殖细胞诱导分化的研究姓名：任卫青申请学位级别：硕士专业：临床兽医学指导教师：王新庄201205河南农业大学2012届硕士研究生论文昆明小鼠胚胎干细胞分离培养及其向原始生殖细胞诱导分化的研究摘要目前，已建立的小鼠ES细胞系大多来源于129、C57BL／6J和BALB／C品系的小鼠，昆明小鼠作为我国科研工作中常用的实验动物，其建系的报道较少，因此建立昆明小鼠胚胎干细胞系对我国深入而便利地开展ES细胞以及其它生命科学领域的研究具有重要意义。SCl是一种小分子化学物，可以双重抑制Ras．GAP和ERKI，维持胚胎干细胞未分化状态。另外，

2、近几年，已有多篇关于胚胎干细胞(Embryonicstemcells，ES细胞)在体外诱导条件下分化为原始生殖细胞(Primordialgermcells，PGCs)，并进一步生成成熟配子的报道，但Es细胞向生殖细胞的诱导效率很低。本研究用昆明小鼠胚胎作为试验对象，比较了不同培养条件对昆明小鼠ES细胞分离培养的影响，研究了小分子化学物(Pluripotin，SCl)对昆明小鼠ES细胞未分化状态的维持作用，并用视黄酸(Retinoicacid，RA)对分离到的ES细胞向PGCs诱导分化进行了初步研究，为昆明小鼠ES细胞建系及向生殖细胞的体外分化研究提供参考。1．利用MTT法检测丝裂霉素C(1

3、0tttg／mL)处理不同时间后小鼠胎儿成纤维细胞(Mouseembryonicfibroblast，MEF)活力变化情况。结果表明，以3代以内MEF制备饲养层，用浓度为10Ltg／mL的丝裂霉素C处理2~2．5h，MEF活力最稳定，可以维持小鼠胎儿成纤维细胞7d以上不增殖也不死亡，是制备饲养层的适宜条件。2．将见栓后3．5~4d的胚胎分别接种于密度为1×104、1×105、1×106／mL的饲养层上，比较胚胎在不同密度饲养层上贴壁、内细胞团(Innercellmass，ICM)集落形成及ES细胞的克隆生长情况。同时，以无血清培养基为基础培养液，研究胚胎发育阶段和培养液中添加不同生长因子对

4、昆明小鼠ES细胞增殖的影响。结果显示，胚胎在密度为1×105／mL的饲养层上，F1代和F2代ES细胞集落出现率均显著高于其他2组(p(0．05)。囊胚的F2代ES细胞克隆出现率显著高于桑葚胚(P<0．05)，培养液中同时添加干细胞因子(Stemcellfactor，SCF)和胰岛素的胚胎贴壁率及F1、F2代ES细胞集落出现率显著高于其他2组(P<0．05)。对分离的ES细胞进行形态观察、碱性磷酸酶(A11(alinephosphatase，AKP)染色，免疫荧光染色检测小鼠ES细胞全能性特异标志物的表达，证实所分离的ES细胞符合小鼠ES的一系列特征。由此认为，发育至囊胚的胚胎在饲养层密度为

5、1×105／mL上，培养液中同时添加胰岛素和SCF适合昆明小鼠ES细胞的分离培养。3．比较了在含血清替代品(Knockoutserumreplacement，KSR)的高糖DMEM培养液中(H—DMEM)分别添加SCl和白血病抑制因子(Leukemiainhibitoryfactor，LIF)对昆明小鼠Es细胞未分化状态的维持作用，并探讨了SCI在培养液中的最佳浓度。以MEF为饲养层，以含LIF的无血清胚胎干细胞培养液为对照，分别用浓度为300nM、1¨M、3“M的河南农业大学2012届硕士研究生论文SCl代替LIF对昆明小鼠胚胎进行分离培养。结果显示，胚胎在添加3gmSCl的培养液中IC

6、M集落形成率显著高于对照组(P<0,05)，形成的ES集落与对照组形态差异不明显，最高传至第7代，并且在无饲养层条件下可以传至第6代而保持未分化状态。不同浓度SCI培养液中，胚胎在SCI浓度为300nM组的F2代Es细胞集落出现率显著高于lgM和3“M组(尸

7、养法使分离到的第3代Es细胞形成类胚体(Embryonicbodys，EBs)，将第3d形成的EBs，接在铺有0．1％明胶的48孔板中，5个EB／孑L，分别川浓度为0．2¨M、1斗M、5“M的RA和不加RA的培养液进行培养。第10d免疫荧光染色的结果表明，浓度为1gM的RA诱导小鼠ES细胞分化为PGCs的效率显著高丁其它组(P<0．05)，SCP3平IIVASA的阳性率表达率分别是31．8％和30．4％，均高于其它组，表