小鼠原始生殖细胞定向分化为神经样细胞的研究

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1、小鼠原始生殖细胞定向分化为神经样细胞的研究【摘要】目的：探讨微囊对原始生殖细胞(PGCs)定向分化为神经样细胞的诱导效果。方法：用原代PGCs经悬浮培养获取类胚体(EBs);将孕13d胎鼠的大脑半球取出，将其中的神经干细胞(NSCs)作为包在微囊里的成分。待EBs贴壁后将含有NSCs的微囊放入其中，同时另外孔板中放入等量的EBs让其自然分化。将微囊诱导分化出的细胞进行NESTIN、NSE和GFAP免疫染色鉴定。结果：用微囊诱导定向分化为神经样细胞的比例显著高于自然分化的比例。结论：悬浮培养可使PGCs形成EBs，将EBs贴壁培养可自发分化形成内、

2、中和外三个胚层的细胞，即上皮样细胞、成纤维样细胞和神经样细胞。通过微囊的诱导方法可以使EGs定向分化为神经样细胞。【关键词】原始生殖细胞;细胞分化;ethods:Tookcerebrafromthe13daysoldmouseembryos,encapsulatedneuronalstemcells(NSCs)collectedfromthecerebraintomicroencapsulation.EBs(embryoidbodies)edfromthePGCscollectedfrom13daysmouseembryosbysuspensi

3、onculture.Themicroencapsulationore,thesameamountofEBsicroencapsulationforspontaneousdifferentiation.Theneuronalcellsmunohistochemicalstaining.Results:TherateofdifferentiationbymicroencapsulationthemicroencapsulationentertheculturemediumandcaninducethedifferentiationofEBsinton

4、euronalcellseffectively.　　[KEYouse　　原始生殖细胞(primordialgermcells,PGCs)是一种胚胎源性干细胞，具有体外分化为各种组织的能力[1]，我们已探讨了其体外自发分化的能力，发现其分化为神经样细胞的百分比最大。为了进一步提高神经样细胞的分化率，本文将重点探讨PGCs向神经样细胞定向分化的新方法，即微囊诱导法。　　1材料与方法　　1.1材料　　ICR小鼠。　　1.2方法　　1.2.1PGCs的分离、提取和体外培养实验使用自配13d胎鼠，取两侧生殖嵴，用PBS洗3次后添加0.25%胰蛋白酶消化，吹

5、打，然后过60目细胞筛，将PGCs按2.5×106/mL的密度接种于35mm的培养瓶中进行体外培养。　　1.2.2悬浮培养(1)类胚体(embryoidbodies，EBs)的形成：取分离提取的PGCs，置于培养瓶中进行悬浮培养，培养期间每隔1～2h摇晃1次培养瓶防止PGCs贴壁。换液方法：将含细胞的培养液放入离心管里1000r/min离心10min，弃上层液体，补足培养液。(2)EBs的鉴定:使用免疫组织化学法，对EBs进行甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)标记，将悬浮培养4d的EBs经4%多聚甲醛固定15min，然后用甲醇在

6、-20℃固定5min，5%BSA覆盖EBs，处理45min以封闭非特异性染色。然后滴加一抗(兔抗人AFP多克隆抗体工作液购自中杉公司，ZA0008)，在4℃孵育过夜，继之滴加生物素化山羊抗兔IgG，最后滴加DAB显色。　　1.2.3微囊制作(1)神经干细胞的提取及鉴定：①将孕13d胎鼠的大脑半球取出，在解剖镜下剥去软脑膜，然后将其置于预冷的含有谷氨酰胺的高糖DMEM培养液中，最后用PBS冲洗3遍，再加入0.25%胰蛋白酶于37℃水浴消化10min，每3min摇匀1次。消化完毕后将消化液吸出，然后加入培养液终止消化,吹打成单细胞悬液后放入37℃，

7、5%CO2培养箱中培养。所用培养液为高糖DMEM，内添加10%FBS(Hyclone)和200mML谷氨酰胺(Lglutamine,LGlu)(Hyclone)和1∶1的青链霉素。②将形成的神经球放入预先用0.05%PL多聚赖氨酸(Sigma)包被的含有盖玻片的小皿中培养24h后，使用免疫组化的方法对神经干细胞巢进行Nestin标记。(2)微囊制作：首先将含原代NSCs的培养液1000r/min,离心5min,加入上述培养液调整NSCs的浓度为1.8×106/mL，将该细胞悬液与1.5%海藻酸钠(Sigma)1∶1混合，避免气泡的产生。

8、然后用装有4号针头的1mL注射器将液滴均匀并快速的滴入含1.1%CaCl2的小皿中，形成凝胶珠，吸掉CaCl2后加入0.05%PL多