胚胎干细胞的培养及其向间质干细胞分化的研究.pdf

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1、MASTER’SDISSERTATIoN胚胎干细胞的培养及其向间质干细胞分化的研究STUDYoFTHECULTUREoFEMBRYoNICSTEMCELLSANDDIFFERENTlATIoNoFEMBRYoNICSTEMCELLSINTOMESENCHYMALSTEMCELLS学科专业监废检验途逝堂作者姓名鏖全慧指导教师胡矗波副教授答辩日期2Q!至生鱼且兰目II强参<学位论文版权使用授权书㈨圳IJ『

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8、If『fⅢY1895183江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社有权保留本人所送

9、交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致，允许论文被查阅和借阅，同时授权中国科学技术信息研究所将本论文编入《中国学位论文全文数据库》并向社会提供查询，授权中国学术期刊(光盘版)电子杂志社将本论文编入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》并向社会提供查询。论文的公布(包括刊登)‘授权江苏大学研究生处办理。本学位论文属于不保密田。学位论文作者签名：麻夸罄矽，，年钼J『日独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论

10、文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果，也不包含为获得江苏大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文识到本声明的法律结果由本分类号盟丝：】!UDC616密级坌珏编号102995081401—3硕士学位论文胚胎干细胞的培养及其向间质千细胞分化的研究STUDYoFTHECULTUREOFEMBRYoNICSTEMCELLSANDDIFFERENTIATIoNOFEMBRYONICSTEMCELLSINToMESENCHYMALSTEMCELLS作者姓名：麻全慧一·二，·指导教师：胡嘉波副教授小组成员

11、：j。周红教授钱晖副教授谷俊侠．副教授申请学位：硕士学科专业：。临床检验诊断学论文提交日期：2011年4月28日论文答辩日期：2011年6月3日学位授予单位：江苏大学学位授予日期：2011年6月19日答辩委员会主席：许文荣教授基金资助：江苏大学高级人才专项资助(093DG037)江苏大学科技创新团队和拔尖人才项目(2008—018一02)(mouse以MEF作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞(humanembryonicstemcell，hESC)。探讨hESC定向分化为间质干细胞的方法与机制，初步研究人胚胎干细胞来源的间质干细胞(humanembryonics

12、temcell．derivedmesenchymalstemcells，hESC．MSCs)的基本生物学特性。方法用0．083％、0．125％、0．25％的胰酶分步消化组织块分离培养MEF，对MEF形态、生长曲线、细胞周期、贴壁率、细胞化学染色、冻存与复苏等特性进行观察研究。以3代以内的MEF作为饲养层培养、传代hESC，观察其未分化特性。分别用机械法、拟胚体法分离、培养、纯化hESC．MSCs，对其形态、生长特性进行观察，用流式细胞术、免疫荧光检测细胞表面标记，核型分析检测其染色体，细胞化学染色观察其生物化学特性，RT-PCR测定相关基因的表达情况。并用丝

13、裂霉素处理，观察其作为饲养层支持hESC生长的能力。结果胰酶分步消化法获得的MEF为长梭形，冻存复苏后的MEF在体外培养30min时80％以上细胞贴壁，生长曲线显示细胞增殖活跃，细胞化学染色AKP、PAS、POX阴性。hESC在MEF饲养层上传30代以上其形态保持不变，AKP染色阳性，具有自发分化形成胚胎干细胞的培养及其向问质干细胞分化的研究拟胚体的能力。机械法、拟胚体分化法共得到3株hESC．MSCs，其形态一致，呈细长梭形，体积较大，与骨髓间质干细胞相似；hESC．MSCs生长曲线显示细胞增殖较快，第3天生长速度开始加快，第7天达到高峰；细胞化学染色显示

14、AKP、POX为阴性，PAS为弱阳性；流式分析表面标记显示hESC．MSCs表达CD29、CD44、CDl3，但不表达CDl4、CD31、CD34、CD45、HLA．DR；hESC．MSCs核型仍然为46，XY；hESC．MSCs表达间质干细胞相关基因nucleostemin、TGF．D、N．cadherin、sall-4、snail、twist，不表达上皮细胞相关基因E．cadherin。作为饲养层可以支持hESC生长。结论胰酶分步消化法是分离MEF的较好方法，此方法所获得的MEF经冻存复苏后有较高的生物学活性，可支持hESC传代、培养，并保持hESC未分

15、化特性。hESC在体外能分化为间质干细胞，hESC．