共培养诱导胚胎干细胞向软骨细胞分化的研究

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1、上海交通大学硕士学位论文共培养诱导胚胎干细胞向软骨细胞分化的研究姓名：石伦刚申请学位级别：硕士专业：外科学（整形外科）指导教师：张文杰20090401上海交通大学硕士学位论文GAGGlycosaminoglycan葡糖胺基聚糖DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜P5Passagethree第五代（细胞）上海交通大学硕士学位论文上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重

2、要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海交通大学硕士学位论文上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日

3、期：年月日日期：年月日上海交通大学硕士学位论文共培养诱导胚胎干细胞向软骨细胞分化的研究摘要种子细胞来源不足是制约组织工程应用与发展的瓶颈问题，人胚胎干（ES）细胞的成功建系，为种子细胞来源开辟了新的途径。然而如何建立经济、有效的ES细胞定向诱导分化方案，是将ES细胞用于临床治疗的关键和难点。现有诱导ES细胞向软骨分化方法仍不成熟。前期实验通过软骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养方法，证实软骨细胞能够提供诱导干细胞向软骨细胞分化所需的生长因子或微环境。本课题将突破传统利用生长因子单一因素诱导ES细胞分化的模式，采用与软骨细胞共培养的方法，建立多因素联合诱导ES细

4、胞分化模式，为ES细胞走向临床应用奠定技术基础，同时共培养模式也将为研究诱导ES细胞向其他细胞系的分化提供极有意义的参考。目的通过胚胎干细胞(embryonicstemcell,ES)与成熟软骨细胞共培养的方法，探讨共培养系统诱导ES细胞定向分化的可行性，建立经济而有效的ES细胞定向诱导分化方案。方法1.实验一，体外凝胶系统构建软骨方法的建立。将胎猪关节软骨消１上海交通大学硕士学位论文化传代，取第2代的软骨细胞种于鼠尾Ⅰ型胶原制成软骨细胞鼠尾Ⅰ型胶原凝胶，体外普通培养液培养4周，然后将细胞凝胶复合物植入裸鼠皮下3周，对照组为细胞凝胶复合物体外继续培养3周，

5、将体外4周，体外7周和体外4周+体内3周的标本取材，石蜡包埋切片后行HE染色、甲苯胺蓝染色、藏红花染色和抗Ⅱ型胶原（anti-humancollagenⅡ）免疫组织化学染色，检测软骨组织形成情况，验证鼠尾Ⅰ型胶原能否作为体外软骨构建的支架材料。2．实验二，人胚胎干细胞向间充质干细胞分化与鉴定。将人胚胎干细胞常规传代培养后在无血清条件下悬浮培养形成类胚体，10天后在含血清条件下使类胚体贴壁生长，5-6天后机械法剔除类胚体中心区高密度重叠细胞，保留周边铺展细胞，并传代扩增周边的细胞，扩增细胞取第5代做流式检测细胞分析细胞表型及免疫荧光染色，并做成脂肪、成骨及成

6、软骨的诱导分化。诱导一定时间后分别做油红染色，碱性磷酸酶染色，茜素红染色，藏红花染色，抗Ⅱ型胶原免疫组织化学染色及RT-PCR分析，检测细胞的成脂、成骨及成软骨的能力，鉴定从人胚胎干细胞分化来源的细胞是否为间充质干细胞或前体细胞。3．实验三，人胚胎干细胞分化来源间充质干细胞与软骨细胞共培养。取第7代人胚胎干细胞分化来源的间充质干细胞与第2代猪关节软骨细胞按1：1的比例混匀于鼠尾Ⅰ型胶原凝胶中共培养，对照组为相同细胞密度的单纯间充质干细胞混于鼠尾Ⅰ型胶原凝胶中，或相同细胞密度的单纯第2代猪关节软骨细胞混于鼠尾Ⅰ型胶原凝胶中，体外普通培养液培养5周后取材，石蜡

7、切片后分别做HE染色、抗人Ⅱ型２上海交通大学硕士学位论文胶原（anti-humancollagenⅡ）免疫组化及抗人细胞核免疫组化染色，检测软骨生成情况和组织中软骨细胞来源。结果1．实验一：软骨细胞与鼠尾Ⅰ型胶原凝胶混合后体外培养4周后，形成软骨样组织，HE、藏红花、甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫组化染色可见软骨陷凹形成，但组织成熟度低，软骨陷凹小，Ⅱ型胶原等细胞外基质分泌少；进一步植入裸鼠体内3周后形成典型的软骨组织，中央为成熟的软骨细胞，周边为不成熟的软骨细胞，软骨陷凹明显，Ⅱ型胶原等细胞外基质分泌旺盛；而体外培养4周的细胞胶原复合物如果继续在体外培养3周后也

8、形成软骨样组织，但软骨陷凹比较小，组织不成熟，中央部跟周边部软骨细