无血清条件培养基法诱导人胚胎干细胞成软骨分化的研究

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1、无血清条件培养基法诱导人胚胎干细胞成软骨分化的研究Serum-Free,ChemicalDefinedConditionsforChondrocytesDifferentiationfromHumanEmbryonicStemCells作者姓名：杨丹聃专业名称：生物医学工程指导教师：周余来教授学位类别：医学硕士答辩日期：2015年5月25日中文摘要关节软骨作为关节中至关重要的部分，具有缓解关节面摩擦，减轻骨骼运动压力等重要作用。但由于其缺乏自我修复的能力，一旦遭受外界创伤或衰退将造成关节软骨损伤、骨关节炎等软骨疾病，很难治愈。干细胞移植技术为软

2、骨疾病的修复带来希望。人胚胎干细胞(humanembryonicstemcells，hESCs)由于其无限的增殖能力及多向分化潜能等优点，作为种子细胞明显优于成体干细胞或祖细胞；其个体差异小的优势使其能够快速建立分化平台，同时为iPSCs的相关研究奠定基础。通过体外诱导hESCs成软骨分化可以获得适宜的软骨组织及足够数量的软骨细胞,为软骨修复提出有别于传统治疗的新途径。在本课题中，我们采用两个阶段对hESCs进行软骨分化：中胚层分化阶段和从中胚层向软骨分化阶段。分化过程应用无血清的条件培养基，采取多种生长因子及小分子的组合。hESCs来源的软骨

3、中胚层分化的条件培养基中主要包括CHIR(一种高效、特异的GSK-3抑制剂，主要作用是激活WNT信号通路)，Noggin(BMP通路抑制剂)；后期从中胚层细胞向软骨分化时应用3D微球法培养，并结合了对软骨分化有促进作用的因子PDGF、TGFβ、BMP等。3D微球培养后，细胞显示了显著的软骨相关性质，形成了透明软骨样球状团块。在分化过程中，从形态变化、基因水平、蛋白水平、组织学染色等方面进行了体外检测，并通过体内移植实验进一步验证形成的软骨细胞，从而评价本课题方法对未来软骨修复的可应用性。实验结果显示，经过中胚层分化，细胞主要表达MEOX1转录因

4、子并显示-+KDRPDGFRα表型,证明细胞经过轴旁中胚层向透明软骨方向分化；后期软骨分化检测结果表达SOX9等软骨祖细胞基因及COL2、COMP等软骨基质基因，免+-疫组化显示COL2COL1,阿利新蓝、甲苯胺蓝等结果表明基质含丰富的蛋白多糖，这些鉴定说明在体外无血清的诱导条件下hESCs向透明软骨方向分化；通过细胞因子组合分化条件的探索发现，中胚层分化后若持续添加BMP4会导致阿尔新蓝染色变浅，显示基质中蛋白多糖含量减少不利于软骨分化；将分化的软骨细胞或软骨组织移植入免疫缺陷鼠体内，仍然能够维持软骨表型，并发现细胞在I体内进一步分化成熟。综

5、上所述，课题初步证明了通过无血清条件培养基可以诱导hESCs成软骨分化，并取得理想的分化结果和较高的分化效率。这不仅为胎肝干细胞在体外进行软骨诱导提供新的实验依据，也为未来应用干细胞疗法治愈骨关节炎、关节软骨损伤等软骨疾病奠定基础。关键词：胚胎干细胞；软骨；分化；无血清IIAbstractArticularcartilageisvitallyimportantinthejoints,whichrelievejointsurfacefrictionandreducethepressureofskeletalmotion.Becauseitslac

6、kstheintrinsiccapacitytorepairitselfthroughregeneration,articularcartilageishighlysusceptibletodamageininjuryordegenerativeconditions,anditisdifficulttobecure.Onepromisingtreatmentforrepairingdamagedcartilageisthetransplantationofstemcells.Humanembryonicstemcells(hESCs)havec

7、onsiderableadvantagesoveradultstem/progenitorcellsasseedcells,duetotheircapacitiesofunlimitedproliferationandmulti-lineagedifferentiation.Theyhavesosmallindividualdifferencesthattheycanquicklybuilddifferentiatedplatform,whilelayingthefoundationforstudiesofiPSCs.Thedifferenti

8、ationfromhESCsinvitroproposesnewwaysdifferentfromtraditional,thereisaccesst