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1、体外非接触性共培养对MSC向软骨细胞诱导分化实验观察［摘要］目的：探讨骨髓基质干细胞(MSCs)与软骨细胞体外非接触性共培养成软骨的可行性。方法：分离、培养、扩传兔MSCs及软骨细胞，MSCs以1X105个/ml接种于共培养板内孔，第1代软骨细胞以1X104个/ml接种于共培养板外空板。48h后将内孔插如外孔中，补充全培养基覆盖于MSC细胞层上。以相同密度MSC单独培养为空白对照，观察共培养7d和14d流式细胞仪观察MSC的II型胶原蛋白变化情况。结果：实验空白组在7d和14d,II型胶原蛋白均阴
2、性表达，符合MSC特性。非接触共培养1周后，II型胶原蛋白阳性表达，与空白对照比较，P1.2方法1.2.1兔MSCs的分离培养用肝素化的无菌注射器抽取骨髓液4~5ml,淋巴细胞分离法提取MSC,以细胞数1X105个/ml,接种于培养瓶中，置于37°C.5%CO2培养箱中恒温培养。于第3天取出培养瓶，倒掉细胞悬液(其中含未贴壁细胞)，以后每3〜4天换液1次。观察细胞达80%融合后，加入1：1的2.5g/L胰蛋白酶和0.2g/LEDTA混合液，消化，传代，MSCs重新接种至两个75ml培养瓶中，反复传
3、代、扩增、纯化，传至第4代备用［4］。1.2.2兔软骨细胞的分离与培养将青紫蓝兔血栓处死，在无菌操作下从其四肢的关节中取出软骨，将软骨切成1〜3mm3大小置无菌试管,PBS冲洗3次，800转/min离心3min,吸去PBS,加2g/L胰酶4ml,CO2孵箱30min,吸出胰酶后再加入2g/LII型胶原酶5ml,置孵箱内消化6〜8ho观察大部分软骨块被消化后，收集消化液，800转/min离心3min,用培养液洗2次。细胞记数后移入25ml培养瓶中，使细胞密度为2X104个/L,加DMEM-F12培养
4、液（含100ml/L胎牛血清，1X105U/L青霉素，50mg/L维生素C,0.15g/L谷氨酰胺），于37°C,C02孵箱中培养，每2天换液1次。原代细胞贴壁并融合成单层后传代培养。1.2.3MSCs的鉴定MSCs可以通过流式细胞仪检测特异性抗原CD34、CD45和CD105来鉴定其纯度［5］。使用直接标记法标记CD34和CD45,取细胞悬液到离心管中，1000转/min离心5min。用含有1%BSA的无酚红DMEM混匀底部细胞，分别加入单克隆鼠抗兔抗体（抗CD34-PE,抗CD45-PE）和非
5、特异性鼠抗兔IgG-PE,冰箱闭光保存40minePBS液洗涤3次，放入流式细胞仪中鉴定，以未标记的细胞设仪器参数，以非特异性鼠抗兔IgG-PE组为阴性对照，记录实验数据。间接标记法标记CD105,在加入一抗为CD105鼠抗兔一抗（稀释1:100）后，4工冰箱保存40min,然后用含有1%BSA的无酚红DMEM洗涤细胞3次，重新用含有1%BSA的无酚红DMEM混匀底部细胞，加入羊抗鼠含荧光标记物FITC的二抗，41冰箱闭光保存40minePBS液洗涤3次，放入流式细胞仪中鉴定，以未标记的细胞设仪器
6、参数，以非特异性鼠抗兔IgG代替一抗组为阴性对照，记录实验数据。1.2.4非接触性共培养取第3代MSCs,以1X105个/ml接种于共培养板内孔，取第1代软骨细胞1X104个/ml接种于共培养板外空板。48h细胞扒壁后换液，并将内空插如外空中，补充全培养基覆盖于MSC细胞层上。示意图如图1。共培养7d和14d流式细胞仪观察MSC的II型胶原蛋白变化情况。无共培养MSC为空白对照组。间接标记法标记兔II型胶原蛋白，在加入一抗为II型胶原蛋白鼠抗兔一抗冰箱保存40min,然后用含有1%BSA的无酚红D
7、MEM洗涤细胞3次。重新用含有1%BSA的无酚红DMEM混匀底部细胞，加入羊抗鼠含荧光标记物FITC的二抗,QC冰箱闭光保存40min。PBS液洗涤3次，放入流式细胞仪中鉴定，以未标记的细胞设仪器参数，以非特异性鼠抗兔IgG代替一抗组为阴性对照，记录实验数据。2结果2.1细胞形态观察2.1.1MSCs培养MSCs呈纺锤形或梭形，原代呈集落样生长，接种后8-10d可达80%以上的融合，此时细胞相互间紧密贴附，单个细胞呈狭长梭形，从整体看大多数细胞沿胞体长轴呈有序排列。传代培养后细胞不再以集落方式生长
8、，而是以均匀分布的纺锤形细胞形态平均生长(图2A)。2.1.2软骨细胞培养各时间段获得的细胞接种后24h,只有少量细胞贴壁，48h后有较多量细胞贴壁，但贴壁不牢,轻轻晃动培养瓶后贴壁细胞容易脱落，72h后大多数细胞均已贴壁，部分细胞向外伸展，呈椭圆形或多角形，5d左右细胞形成集落，原代细胞10〜12d长满瓶底，呈铺路石样。传代细胞约12h贴壁，7d左右可以长满瓶底(图2B)。2.2MSCs鉴定结果通过流式细胞仪分析，3组(n二3)不同抗原标记显示所培养MSCsCD34(-)、CD4
