体外非接触共培养诱导骨髓间充质干细胞向肺泡上皮细胞的分化

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1、体外非接触共培养诱导骨髓间充质干细胞向肺泡上皮细胞的分化：王艳，杨志军，何玺玉，封志纯【摘要】目的建立体外非接触共培养模型，诱导小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向肺泡上皮细胞的分化。方法分三组，每组6例。对照组：小鼠MSCs单独培养组；实验组A：正常肺组织单细胞悬液+MSCs；实验组B：损伤肺组织单细胞悬液+MSCs。共同培养8d，激光共聚焦和RT-PCR检测共培养体系下室中的SP-C和AQP5的表达情况。结果对照组和实验组A都只检测到AQP5；而实验组B可同时检测到AQP5和SP-C。实验组B的AQ

2、P5mRNA的表达量较对照组明显增多(P<0.01)，而与实验组A比较，其AQP5mRNA的表达量也有统计学差异(P<0.01)。但是，实验组A与对照组比较则无明显统计学差异(P>0.05)。结论本实验室成功建立了体外非接触诱导小鼠MSCs分化为肺泡上皮细胞的实验模型。【关键词】骨髓间充质干细胞；肺泡上皮细胞；激光共聚焦ChinaABSTRACT:ObjectiveToestablishtheco-culturemodelinvitroandinducebonemarroesench

3、ymalstemcells(MSCs)todifferentiateintolungalveolarepithelialcells.MethodsEachgrouphad6samples,controlgroupnormallung;andGroupBinjuriedlung.EachgrouparkersoflungalveolarepithelialcellsincludingAQP5andSP-CicroscopyandRT-PCR.ResultsOnlyAQP5RNAexpressioninG

4、roupBRNAexpressioninGroupBRNAexpressionbetodelinvitrotoinducebonemarroesenchymalstemcellstodifferentiateintolungepithelialcells.　　KEYSCs)是一种具有多分化潜能的干细胞，在不同的培养条件下可分化为一系列的细胞类型。肺损伤体内实验研究表明，肺损伤小鼠移植MSCs后，MSCs可转化为肺泡Ⅱ型(typeⅡalveolarepithelialcell,AECⅡ)和Ⅰ型上皮细胞(

5、typeⅠalveolarepithelialcell,AECI)等，以修复损伤肺组织[1]。ROJAS等[2]研究发现，在体外损伤肺组织分泌的因子可以诱导MSCs增殖并向损伤肺迁移，而正常肺组织细胞并没有此功能。POPOV等[3]采用MSCs与肺上皮细胞(A549)非接触共同培养，成功诱导MSCs向肺上皮细胞分化。本研究采用MSCs与肺组织单细胞悬液非接触共培养模型，观察能否在体外利用损伤肺组织诱导MSCs向肺泡上皮细胞分化,为进一步研究骨髓源性的间充质干细胞治疗肺损伤奠定基础。　　1材料与方法　　

6、1.1材料　　出生4周的健康昆明小鼠，体重为10.0～11.5g，共25只，均为雄性(中国医学科学院实验动物中心提供)。DMEM完全培养基和标准胎牛血清(GIBCO公司，美国)，胰蛋白酶(Sigma公司，美国)。TaqDNA聚合酶(TaKaRa公司，日本)，RT-PCR试剂盒(QIAGEN，德国)。倒置显微镜(TE2000,Nikon公司，日本)，高分辨率成像系统(DXM1200C，尼康，日本)，激光共聚焦显微镜(C1-SHS，尼康公司，日本)，二氧化碳细胞培养箱(SKP-02B，湖北省黄石市恒丰医疗

7、公司)，24孔板(HangingCellCultureInsertPET0.4μm，MILLPORE公司，德国)。　　1.2小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外分离、扩增和鉴定　　小鼠颈椎脱臼处死后，放入750mL/L的酒精内浸泡5min。无菌条件下取出双侧股骨，去除附带组织，两端剪断暴露骨髓腔。用含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液及1号针头反复冲洗，将骨髓腔内的骨髓冲出，并用1号针头反复抽吸，制成单细胞悬液，充分混匀，转入离心管，1500r/min离心5min弃上清及脂肪层，沉淀用DMEM培

8、养液充分混匀，用吸管轻轻叠加到密度为1.077g/mL的Ficoll-Paque分离液上，2500r/min离心10min，取界面层的单核细胞，再用DMEM培养液多次洗涤，离心后备用。细胞沉淀以5×105个/cm2密度接种于培养瓶，加入DMEM完全培养液置于37℃，50mL/LCO2，80%相对湿度的培养箱中，2d后全量换液，去除未贴壁的细胞，以后每隔3d换液1次，倒置相差显微镜逐日观察细胞的形态，贴壁情况及生长情况。待细胞融合达80%，胰酶37℃消化，