人类胚胎干细胞和小鼠孤雌胚胎干细胞系的建立和鉴定

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1、人类胚胎干细胞与小鼠孤雌胚胎千细胞系的建立与鉴定人类胚胎干细胞与小鼠孤雌胚胎干细胞系的建立与鉴定硕士研究生：银益飞指导老师：孙筱放教授中文摘要胚胎干细胞具有自我更新及多向分化潜能，为胚胎发育学、遗传学、人类疾病的发病机理与替代治疗等研究提供非常宝贵的资源。由于不同来源的hES细胞株HLA等遗传背景不一样，其应用价值也不同，因此需要建立更多的hEs细胞株来满足临床与基础等研究的需要。人类胚胎来源有限，获得更多hES细胞系的根本途径是改善培养体系，提高建系率。孤雌胚胎干细胞的研究可以避免伦理的限制，并且在细胞移植时不存在免疫排斥反应，能够保证治疗的有效性，成为

2、近期研究的热点。本实验首先探讨影响hES细胞建系的因素，建立一套稳定高效的hES分离培养体系，并建立废弃胚胎来源的hES细胞系；进一步激活小鼠卵母细胞，建立小鼠孤雌胚胎干细胞系，为人类孤雌胚胎干细胞及核移植胚胎干细胞建系研究奠定基础。第一部分人类胚胎干细胞建系方法的改良与废弃胚胎来源的人胚胎干细胞系的建立与鉴定第一章hES细胞建系方法的改良及hES细胞系的建立【研究目的】对hES细胞分离培养体系进行改良，建立废胚来源的hES细胞系。【材料方法】1．收集IVF／ICSI治疗周期第三天的低质量胚胎，体外培养至D5，D6天时，将早期囊胚转入含有hLIF及bFGF

3、细胞因子的G2．3培养液内继续培养l～2天，观察囊胚ICM变化。2．采用机械法与免疫外科法分离ICM，对比两种方法获得的原代克隆质量及建系人类胚胎干细胞与小鼠孤雌胚胎干细胞系的建立与鉴定情况。3．在hES培养液内添加不同浓度的曲s及SR，比较其对hES建系的影响。4．采用机械法、胶原酶Ⅳ消化及胰酶消化进行hES的传代，比较三者对hES细胞扩增效率的影响。【结果】1．G2．3培养液内添加hLIF及bFGF后，其优质囊胚形成率明显增高(74．19％VS31．5D％)。2．机械法与免疫外科法分离ICM的原代克隆的形成率无显著性差异，但机械法操作相对简单快速。3．

4、FBS培养液组，ICM贴壁率高，但克隆易分化；sR组贴壁率相对低，克隆不易分化但增殖缓慢；同时添加FBS及SR的培养液组，hES建系率最高。4．机械法、胶原酶IV消化及胰酶消化三种传代方法中，胶原酶消化组效果最好，机械法其次，胰酶消化组最差。5．成功建立了4株废胚来源的hES细胞系(FY—hES—l，FY-hES一2，FY-hES一3，FY．hES-4)，这些细胞均能在体外稳定传代，反复冷冻复苏，其中最早建立的hESl细胞系已传至78代。【结论】1．在G2．3培养液内添加hLIF以及bFGF进行囊胚优化培养，可改善囊胚质量，使IcM明显增殖。2．在hES培

5、养液内同时添加SR以及少量的FBS，可以促进ICM的增殖，减少其分化，提高hES细胞的建系率。3．构建了稳定高效的hES细胞分离培养体系，为人类孤雌胚胎干细胞及核移植胚胎干细胞建系研究奠定基础。4．建立了4株废胚来源的hES细胞系，为发育生物学及遗传学等研究提供新的实验模型。【关键词】囊胚；；内细胞团；人类胚胎干细胞：免疫外科法；机械法一ll—人类胚胎干细胞与小鼠孤雌胚胎干细胞系的建立与鉴定第二章人类胚胎干细胞系的生物学特性鉴定【研究目的】对所建立llES细胞系进行干细胞生物学特性鉴定，了解其应用价值。【材料方法】1．对hES细胞的生长情况进行观察，计算其

6、群体倍增时间。2．所有的hES细胞体外培养至15代后，低密度传代至四孔板，进行AKP以及ES表面抗原SSEA一1，SSEA一4，TRA一卜60，TRA一卜8l染色鉴定。3．Trizol法提取各株hES细胞的RNA，进行RT．PCR反应检测0ct-4转录因子的表达情况。4．hES细胞体外培养至10代后，开始进行染色体核型鉴定，每隔lO代检测一次，每次计数20个分裂像。5．体内外分化能力检测：悬浮培养hES细胞，观察拟胚体的形成，并对自发分化的细胞进行特异性抗原检测；将hES细胞团快接种到SCID小鼠的腹股沟皮下，观察是否有肿瘤生长。6．提取各株hES细胞的D

7、NA，对其16个STR位点进行鉴别。【结果l1．hES细胞的群体倍增时间为32小时左右。2．4株hES细胞系均具有典型的ES克隆形态，AKP染色呈强阳性，能够表达hES细胞表面抗原SSEA一3、SSEA一4、TRA一卜60、TRA一卜8l；不表达SSEA—l。3．4株hES细胞系的Oct一4转录因子表达阳性。4．染色体核型分析，其中3株核型正常(FY一1，FY一2，FY一4)，l株为13易位三体(F1『一3)，核型：46。XX，+13，der(13；13)(qlO；qlo)5．4株hES细胞系均具有体外自发分化形成囊性拟胚体的能力；除了FY-4体内分化能力

8、待测外，其他3株hES细胞均能形成畸胎瘤。6．每株hES细胞系的S