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《小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案经过相关文献阅读，参考了众多对于小胶质细胞培养方案，对比了不同方案的利弊优缺，整合了相对符合本实验室条件和实验要求的方法，如有其他变更方案，以修改后为准。1.实验材料与试剂剪刀、小镊子、小毛刷、DMEM/F12培养液、胎牛血清、马血清、0.25%，0.05%胰蛋白酶、PBS液、青霉素、链霉素、培养皿离心管、50mL细胞培养瓶、CO2恒温细胞培养箱、倒置相差显微镜、细胞板、荧光标记二抗、0.4%TrypanBlue染色液、抗小鼠OX42单克隆抗体和新生SD小鼠等试剂配比：(1)D
2、MEM10:10:1DMEM,10%FBS,10%HorseSerum,1%Penicillin/Streptomycin(P/S)(2)DMEM5:5:1DMEM,5%FBS,5%ofHorseSerum,1%P/S(3)SERUMFREEMEDIUM+GROWTHFACTORS（DMEM/F12无血清培养基+生长因子）25μg/ml转铁蛋白，10nM生物素，30nM亚硒酸钠，1μg/mlputrescine（腐胺），5μg/ml胰岛素，20nMhydrocortisone（氢化可的松），20nMprogestero
3、ne（孕激素），1％P/S+生长因子（5ng/ml的血小板衍生生长因子PDGF-AA和5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子bFGF）胰蛋白酶/EDTA溶液0.05％胰蛋白酶+0.02％EDTA在W/O内Ca2+/Mg2+的HBSSDMEM/F12containing25μg/mltransferrin,10nMbiotin,30nMsodiumselenite,1μg/mlputrescine,5μg/mlinsulin,20nMhydrocortisone,20nMprogesterone,1%P/S+GrowthFa
4、ctors(5ng/mlPDGF-AAand5ng/mlbFGF)Trypsin/EDTAsolution0.05%Trypsin+0,02%EDTAinHBSSw/oCa2+/Mg2+·Laminarflowhood·Dissectingmagnifyingglass·Waterbathat37ºC·Humidifiedtissuecultureincubator(37ºC,5%CO2)·Sterilizedmicrodissectinginstruments:largedissectingscissors,mous
5、e-teethforceps,curvedforcepsandfineDumontforceps·OrbitalShaker(BoecoOS20)·Tabletopcentrifuge·50mlplasticconicaltubes(Sarstedt,62.547.004)·T75cm2tissuecultureflaskswithplug-seal(BDFalcon,137787)·Tissuecultureplates(Falcon)·Petridishes(Sterilin)·30μmsterilenylonme
6、sh(Saatilene,Hitech)2.实验步骤2.1星形胶质细胞的混合培养取新生SD小鼠若干只(出生24h内),在无菌条件下断头,迅速剪开颅骨,取出脑组织至盛有冷PBS液的培养皿中反复冲洗以去除血污;再把全脑移入另一盛有PBS液的培养皿中,用小毛笔轻轻刷去脑表面的脑膜和血管,用PBS液冲洗后剪去脑干仅留大脑半球;用小剪刀充分剪碎脑组织,加入比组织块总量多30~50倍的0.05%胰酶,再移入50mL离心管,用吸管反复吹打消化至肉眼观察无明显的脑组织团块;加入DMEM/F12完全培养基(含10%胎牛血清、100U/m
7、L青霉素和100ug/mL链霉素)终止消化,再次反复吹打制成单细胞悬液,配平,1000r/min,离心5min,弃上清;加定量完全培养液再次制成细胞悬液,更具实验需要接种入若干个50mL细胞培养瓶或者培养皿中,置于5%CO2恒温细胞培养箱(37度)培养;3h后更换1次培养液,以后每3d换1次液,并在镜下观察细胞的生长和存活情况。2.2星形胶质细胞的分离和纯化将培养于培养瓶中的混合胶质细胞上清弃去，用0.01mol/LPBS洗2遍。用无血清培养基0.25%胰酶6mL加入培养瓶，37℃消化15min左右，至镜下观察到大部分
8、星形细胞脱落，将含有星形胶质细胞的消化液立即置于等量含10%FBSDMEM/F12培养基中止消化，1000r/min离心5min，再用PBS洗2遍后，重悬于含10%FBSDMEM/F12培养基中，种于培养瓶中;将培养瓶置于37℃细胞培养箱稳定贴壁1d后，再用37℃恒温定轨摇床，200r/min振摇2h;吸取上清液弃去(其中主要包括
