大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养及腺病毒感染细胞——何久香

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1、威斯腾生物技术中心大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养及腺病毒感染细胞（一）大鼠脊髓星形胶质细胞的原代培养（二）腺病毒感染细胞（一）大鼠脊髓星形胶质细胞的原代培养1、实验前期准备2、脊髓星形胶质细胞的分离3、脊髓星形胶质细胞的培养实验前期准备：实验器械的高压灭菌新生鼠的购买培养瓶的包被（细胞培养前1-2h，培养瓶用0.1％多聚赖氨酸包被，置5％C02培养箱中，使用前用DMEM/F12培养基冲洗干净，吸尽所有多余的DMEM/F12培养基后备用于种板）脊髓星形胶质细胞的分离1、取新生乳鼠6只，75％乙醇皮肤消毒。

2、无菌条件下剪刀断头，打开脊椎后取出脊髓组织并置于盛有DMEM/F12培养基的培养皿中反复冲洗，尽可能洗掉可能附着的表面血细胞。2、使用眼科镊细致的剥离皮层表面蛛网膜，并取出脊髓，在该过程中可适当撕开软脊膜组织一并去掉脊髓组织深面的血管，随后使用冰预冷DMEM/F12反复冲洗。3．在玻璃培养皿中用眼科剪将脊髓组织剪碎致直径0.3mm左右小块，在剪碎过程中避免挤压脊髓组织，加入无菌3ml0.25％胰酶，置37℃细胞培养箱中消化30min至浑浊状。4．加入2-3ml含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基终

3、止消化，静置3min后先用吸管吸去多余液体，再用吸管轻轻地吹打3次，收集细胞悬液，经200目的不锈钢网滤过除去杂质，过滤后的细胞悬液移入10ml无菌离心管中，然后800rpm离心7min。5．弃去上清液，然后每管加入2-3ml含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，接种于培养瓶中，37℃、5％CO2培养箱内孵育60min，进行差速粘附贴壁处理，以去除成纤维细胞。6．轻轻翻转培养瓶，吸出细胞悬液，种于预先涂有多聚赖氨酸的培养瓶；继续在CO2培养箱内培养，接种2-3d后更换新的无菌培养基，隔2-3d换新

4、培养液1次。生长8-10d待细胞融和后，置于37℃恒温摇床机中，180rpm，14-16h。7．丢弃上清液，收集经过摇床震荡后的贴壁细胞，加新鲜培养液继续培养，即可得纯度较高的星形胶质细胞。脊髓星形胶质细胞的培养细胞换液对于贴壁细胞，首先应先吸除培养瓶中旧培养基，用PBS洗2~3次，补加入新培养基后继续培养或实验。细胞传代对于贴壁细胞，首先应先吸除培养瓶中旧培养基，用PBS洗2~3次，50ml培养瓶加入胰酶消化液约1ml，晃动使消化液铺均匀，置37度培养箱约2-5分钟，镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后，

5、轻轻振动瓶底使细胞全部脱落，加入2-3ml完全培养基后，轻轻吹打，收集细胞至离心管，1000转/min离心5min，弃上清，加培养液，轻轻吹打成细胞悬液，按照1：2或1：3的比例传代至无菌培养瓶内，加入培养基后继续培养或实验。（二）腺病毒感染细胞确定腺病毒的最佳感染滴度腺病毒感染细胞确定腺病毒的最佳病毒滴度（96孔板）准备细胞：8000～10000个细胞/孔接种于96孔板病毒稀释：在离心管中用维持液将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1到10-7病毒感染：将稀释好的病毒接种到96孔培养板中，每一稀释度

6、接种一纵排共8孔，每孔接种100ul；设正常细胞对照(两纵排),只加维持液100ul。细胞培养：将培养板放置于CO2培养箱（37℃5%CO2），培养5-7天测定结果：取出培养板，显微镜下观察细胞病变，并用Reed-Muench法计算病毒的最佳滴度腺病毒感染细胞准备细胞准备病毒感染细胞谢谢！