新生大鼠小胶质细胞的分离纯化、培养及鉴定

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1、学术学位硕±学位论文单位代码：１０６７８分类号；Ｒ３２２．別学号：２０１２２巧密级；尾略Ｍ牛Ａ常硕±学位论文戀新生大鼠小胶扇细胞的分离纯化、培养及鉴定院候一）、所昆明医科大学第临床医学院研究生姓名余苏华学科、专业外科学（神经外科）学位类型学术学位指导教师李玉副教授二〇—五年五月見咚ｉｌ钟常硕±学位论文新生大鼠小胶质细胞的分离纯化、培养及鉴定研究生姓名余苏华学科、专业外科学（神经外科）申请学位类型学术学位指导教师李玉副教授指导小组教师邓兴力副教授完成日期二〇—五年五月

2、兔略ｉｌ钟Ａ掌研究生学位论文研巧撰写声明本人郑重声明；本学位论文是我本人在导师指导下，独立进行学位课题研究所取得的研巧成果。论文中除特别加标注和致谢的地方外，不包含他人或其他机构已经发表或撰写过的研究成果。对本研巧和论文做过贡献的同道我均在论文中作了明确的说明并表明谢意。该学位论文资料若有不实之处，本人愿承担一切相关责任。论文作者（签名年月；Ｉ曰見畴Ｓ种Ａ常研究生学位论文版权使用授极书本学位论文作者完全了解屋明医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被査阅和借

3、阅，。学校可公布论文的全部或部分内容（确属保密内容已注明并在解密后遵守此规定。）；学校可采用影印、缩印或其他手段保存本学位论文学位论文作者（签名）：指导教师（签名和－年－ｙ月２Ｌ曰户｜＼年］月枉本人及导师同意将学位论文提交至清华大学＂中国学术期刊（光盘版）电子杂志化巧行电子和网络出脱并编入ＣＮＫＩ系列数据库，传播本学位论文的全部或部分内容，同意按《中国优秀博硕±学位论文全文数据库出版章程》规定享受相关权益。、‘学位论文作者（签名）；指导教师（签名）：和＇？年ｆ月曰年月义巧基金巧目：国家自然科学基金资助（编号：８１２４１１２６、

4、８１３６０１９７）目录中文摘要１Ａｂｓｔｒａｃｔ３符号说明６引胃８材料与方法１３１．材料１３１．１主要仪器设备１３１．２实验试剂及材料１４１．３实验动物１４１．４主要溶液配制１４２．１５巧法２１１．海合胶质细胞培养及形态观察５２．２小胶质细胞的分离纯化１７２３１９．细胞计数及台粉蓝染色实验２１．４小胶质细胞的鉴定９２．５小胶质细胞活化模型的建立２０２．６统计学处理２１结果２２１泡合胶质细胞的培养２２２小胶质细胞分离纯化２４３细胞计数及台盼蓝细胞拒染实

5、验２７４免疫英光染色鉴定２９５小胶质细胞活化模型分析３１ＭＶｔ３５结论４２参考文献４３：＾：献综述４８论文发表情况５７ａｍ５８屋明医科大学硕±研巧生学位论文新生大鼠小胶质细胞的分离纯化、培养及鉴定硕±研究生：余苏华导师：李玉副教授昆明医科大学第一附属医院神经外科中文摘要目的：探讨原代小胶质细胞纯化分离培养的方法一，从而建立种简易的、高产量的、高纯度的连续获得小胶扇细胞的体外培养模型，同时建立小胶质细胞活化的模型，为小胶质细胞移植治疗帕金森病的相关实验提供足够细胞材料。方法：￣

6、１．混合胶质细胞的培养：取新生ｌ２ｄＳＤ大鼠，酒精浸泡消毒，断头处死，冷Ｄ－Ｈａｎｋｓ反复冲洗，显微镜下取两侧大脑半球，剔除脑膜、血管，剪碎脑组织，加入族蛋白酶消化，再加入ＤＭＥＭ／Ｆ１２终止消化，巧滤，离也，弃上清液，ｓ重新制成细胞恳液，细胞计数并调整细胞密度至〇ｘｌ〇／ｍｌｌ接种于３个预先涂有多聚赖氨酸的培养瓶中一，随机分成Ａ、Ｂ、ＣＨ姐，，同恒湿培养箱培养２４ｈ后完全换液，３ｄ换液Ｉ次，半量换液。２￣．小胶质细胞的分离纯化；待混合培养第７９ｄ，将随机分成的Ｈ组细胞分离纯化，Ａ组：恒温振荡法；Ｂ组：温和膜酶消化法；Ｃ组：利多卡因分离法。加入培养基

7、重新吹打成细胞悬液，台盼蓝拒染试验分别检测细胞存活率，利用细胞计数板计５ｘ数并调整细胞密度至ＩｌＯ／ｍｌ接种于预先放有盖玻片（多聚赖氨酸包被）的相应Ａ一、Ｂ、ＣＨ个６孔３０培养板中，ｍｉｎ后完全换液次，去除未贴壁细胞，再加入新培养液入同一２４ｈ３ｄ，放恒温培养箱培养继续培养。后完全换液，换液１次。３．小胶质细胞的鉴定；待分离纯化继续培养９ｄ后，再利用ＣＤＨｂ（０Ｘ４２）免疫英光染色对分离纯化的小胶质细胞纯度进行鉴定。４．脂多糖诱导小胶质细胞：收集原代小