大鼠少突胶质细胞的纯化培养与鉴定.doc

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1、大鼠少突胶质细胞的纯化培养与鉴定【摘要】目的探讨新生2dSpragueDawley(SD)大鼠脑少突胶质细胞的分离方法和生长条件，为少突胶质细胞损伤后髓鞘形成障碍或脱髓鞘疾病的研究奠定基础。方法根据星形胶质细胞和少突胶质细胞的生长时间差异、细胞生长方式及细胞对培养层粘附等特性的不同，采用两次恒温摇床振荡分离纯化法和条件限定培养基培养获取并鉴定高纯度的大鼠少突胶质细胞。结果培养出突起有如蜘蛛网状的成熟少突胶质细胞，半乳糖脑苷脂阳性。结论两次恒温摇床振荡分离纯化法和条件限定培养基培养可获取高纯度的大鼠少突胶质细胞。【关键词】少突胶质细胞；细胞培养；纯化；鉴定Abstract：

2、0bjectiveToculture,purifyandidentifytheastrocytesandoligodendrocytesfromratcerebraltissue.MethodsBasedonthedifferentpropertiesofdevelopmentaltimecoursescellularadhesionsandgrowthpatternofastroglialcellsandoligodendrocytesoligodendrocyteswereculturedandpurifiedbyorbitalshakingfortwiceandth

3、edefinedculturemediumandidentifiedbyimmmunofluorescentstaining.ResultsTheripeoligodendrocyteswereculturelactocerebroside.Cweusedwassuitableanoligodendrocytes.Keywords：oligodendandidentifiedbygaonelusionThemethodndeffectivetoobtaidrocyte；cultivation；purification；identification少突胶质细胞是中枢神经系统

4、的髓鞘形成细胞，它起源于胚胎神经管的神经上皮细胞，随着中枢神经系统的发育，逐步迁移到白质，并增殖、分化，形成髓鞘包裹轴突。少突胶质细胞在发育过程中，大体经历了少突胶质细胞/II型星形胶质前体细胞、少突胶质细胞/II型星形胶质袓细胞、未成熟少突胶质细胞和成熟少突胶质细胞几个阶段［1］，其形态、表迗产物和功能呈现一个渐变及连续的过程，并没有严格的界限。在髓鞘形成障碍等疾病研究中，发现脱髓鞘或再生的轴突能否再髓鞘化是影响神经功能恢复的重要原因之一。近年来应用细胞替代治疗已成为一大热点［23］，通过体外培养获得少突胶质细胞，将其移植入髓鞘形成障碍的中枢神经系统内，可揭示髓鞘形成和

5、再生机制［4］。这些实验需要大量的少突胶质细胞，因此必须对少突胶质细胞进行体外纯化和培养。本研究依据星形胶质细胞和少突胶质细胞的生长时间、细胞生长方式及细胞对培养层粘附等特性的不同，采用两次恒温摇床振荡分离纯化法和条件限定培养基培养，以探讨少突胶质细胞的分离方法和生长条件。1材料与方法材料实验动物为新生48h之内普通级SpragueDawley(SD)大鼠，由福建医科大学实验动物中心提供。主要试剂及其配制：①细胞培养的基本试剂。新生胎牛血清、高糖DMEM、DMEM/F12培养基、PBS,TritonX100、多聚赖氨酸、亚硒酸纳、腐胺、转铁蛋白，PDGFAA、bFGF,胰

6、岛素、甲状腺素均为医用试剂。DMEM/F12(1:1)条件培养基A配方为DMEM/F12、10ng/mLPDGF、1Ong/mLbFGF,%FCSoDMEM/F12(1:1)条件培养基B配方［5］为DMEM/F12、亚硒酸钠ug/mL、腐胺mg/L、转铁蛋白5Omg/L、胰岛素5mg/L、甲状腺素Pg/L、碳酸氢钠g/Lo②免疫荧光的主要试剂。小鼠抗大鼠A2B5单克隆抗体(R&D)、兔抗大鼠Gal多克隆抗体、山羊抗小鼠IgM抗体TRITC、山羊抗兔IgGFITCo方法大鼠皮层胶质细胞混合培养取出生48h之内的SD大鼠，无菌条件下取大脑，置入PBS液中，在解剖显微镜下剔除脑

7、膜及血管，分离出大脑皮层。剪碎后，反复机械轻轻吹打，100目滤器过滤，1500r/min离心5min，弃上清。加入培养基高糖DMEM，含15%FCS，使细胞充分分离，然后以1X106的密度接种于预先涂有多聚赖氨酸的培养瓶中，置于37°C、5%C02培养箱中，3d换液一次。纯化及少突胶质细胞诱导分化培养细胞生长7〜8d后可分为两层，用封口膜封闭培养瓶口，置于37°C恒温摇床中，150r/min振荡2h后，吸掉上层培养液，去除小胶质细胞，加入培养基高糖DMEM，含15%FCS,再以250r/min振荡17〜19h,收集脱落细胞于离