大鼠少突胶质细胞的纯化培养与鉴定论文

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1、大鼠少突胶质细胞的纯化培养与鉴定论文【摘要】目的探讨新生2dSpragueDaratcerebraltissue.MethodsBasedonthedifferentpropertiesofdevelopmentaltimecourses，cellularadhesionsandgroediumandidentifiedbyimmmunofluorescentstaining.ResultsTheripeoligodendrocytesethoda），PDGFAA、bFGF（Peprotech），胰岛

2、素、甲状腺素均为医用试剂。DMEM/F12(1∶1)条件培养基A配方为DMEM/F12（1∶1）、10ng/mLPDGF、10ng/mLbFGF、0.5%FCS。DMEM/F12(1∶1)条件培养基B配方［5］为DMEM/F12（1∶1）、亚硒酸钠0.8μg/mL、腐胺16.1mg/L、转铁蛋白50mg/L、胰岛素5mg/L、甲状腺素0.4μg/L、碳酸氢钠2.2g/L。②免疫荧光的主要试剂。小鼠抗大鼠A2B5单克隆抗体(R＆D)、兔抗大鼠Gal多克隆抗体（Chemicon）、山羊抗小鼠IgM抗体TRIT

3、C（SouthernBiotech）、山羊抗兔IgGFITC（中杉公司）。1.2方法1.2.1大鼠皮层胶质细胞混合培养取出生48h之内的SD大鼠，无菌条件下取大脑，置入PBS液中，在解剖显微镜下剔除脑膜及血管，分离出大脑皮层。剪碎后，反复机械轻轻吹打，100目滤器过滤，1500r/min离心5min，弃上清。加入培养基高糖DMEM，含15%FCS，使细胞充分分离，然后以1×106的密度接种于预先涂有多聚赖氨酸的培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中，3d换液一次。1.2.2O2A纯化及少突胶质细胞诱导分

4、化培养细胞生长7～8d后可分为两层，用封口膜封闭培养瓶口，置于37℃恒温摇床中，150r/min振荡2h后，吸掉上层培养液，去除小胶质细胞，加入培养基高糖DMEM，含15%FCS，再以250r/min振荡17～19h，收集脱落细胞于离心管内，1500r/min离心10min，弃上清，加入培养基高糖DMEM，含15%FCS重悬细胞，以3×104／L的密度接种于24孔培养板。置于37℃、5%CO2培养箱中培养6h后吸弃原培养基，改用DMEM/F12条件培养基A继续培养，即可得到纯化的O2A细胞。培养3d后改用D

5、MEM/F12条件培养基B诱导分化，可得到成熟的少突胶质细胞。1.3细胞生物学特性分析1.3.1细胞形态观察倒置荧光相差显微镜（Nikon，TE2000s）观察培养细胞的生长过程和形态学变化。1.3.2细胞免疫荧光鉴定收集含有细胞的玻片，0.01mol/LPBS（pH7.4）洗涤细胞，4%多聚甲醛固定20min，按常规方法进行细胞免疫荧光染色。一抗分别为小鼠抗大鼠A2B5单克隆抗体（5μg/mL）、兔抗大鼠Gal多克隆抗体（1∶50），二抗分别为山羊抗小鼠IgM抗体TRITC（1μg/106cells）

6、、山羊抗兔IgGFITC（1∶200）。空白对照均用PBS代替一抗。2结果2.1细胞形态观察2.1.1混合胶质细胞培养①混合胶质细胞培养第3天，倒置荧光相差显微镜下观察，多数的细胞体积较大，胞体扁平，具有较粗的突起，呈片状，胞核较大，圆形。在位于扁平细胞表面可见一些体积较小，胞体较透亮呈圆形或椭圆形的细胞，具有单极或双极的细小突起。②培养第7～8天，倒置显微镜下观察，胞体扁平，突起粗大的细胞已长满瓶底。在表面有成堆或呈葡萄串样生长的胞体较小、折光性强的细胞（图1）。图1混合胶质细胞培养第7天(×200)2

7、.1.2纯化O2A形态观察24h后细胞成堆聚集形成克隆球，边缘迁移出细胞（图2），克隆球A2B5标记阳性（图3）。第2～3天细胞增殖旺盛。细胞体积较小，胞体较透亮，呈圆形或椭圆形，多数细胞具有双极突起，其突起较细直无分支（图4），A2B5标记阳性（图5）。2.1.3诱导分化后细胞形态观察多数细胞的体积无明显变化，部分细胞胞体增大，细胞突起明显增多，在粗短的初级胞突上出现茂密的次级胞突，且相互交联成蜘蛛网状（图6），细胞GC标记阳性（图7）。2.2免疫荧光鉴定O2A祖细胞A2B5荧光标记呈阳性，红色阳性反应物

8、位于胞体和突起。少突胶质细胞Gal荧光标记呈阳性，绿色阳性反应物位于胞体和突起。空白对照组结果为阴性。3讨论本实验结果观察到混合胶质细胞原代培养7d后，贴壁的星形胶质细胞相互融合形成一层细胞毡，O2A祖细胞则散布其上，因细胞生长缓慢而无法融合。这些表现是因星形胶质细胞和少突胶质细胞的生长特性不同决定的，也为振荡分离O2A祖细胞提供了可能。振荡频率是影响细胞分离的重要因素，国内报道多为80～120r/min，8～1