《山羊毛囊细胞分离培养与鉴定及毛囊体外重塑研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
ShandongAgriculturalUniversityPh．D．DISSERTATIONStudiesonIsolation，CultureandIdentificationofHairFollicleCellsfromGoatandReconstitutionofHairFollicleinVhoDepartment：AnimalmoleculargeneticsMajor：AnimalBreedingAndGeneticsPh．D．Candidate：Zhi-fengCuiSupervisor：ProfHuiWang2013．06．09 关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并向社会公众提供信息服务。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：导师签名：车支’^竺．一褪量 本研究由国家自然科学基金项目(编号：30672498)和山东省科技攻关项目(编号：2012YDl8110)联合资助ThisresearchwassupportedbyNationalNaturalScienceFoundationofChina(30671498)andScienceandTechnologyProgramofShandongProvince(2012YD1810) 符号说明 目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．IABSTRACT⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11●rI弓f言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1山羊的毛囊结构与济宁青山羊毛皮品质⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．21．1．1山羊的毛囊结构⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21．1．2济宁青山羊的毛皮品质⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．2动物毛囊的生理特性及功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．2．I动物毛囊的生长周期⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．31．2．2动物毛囊的细胞组成及功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．41．2．3毛囊的组织分化与发育⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。71．2．4山羊毛囊形态发生的过程⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。81．3毛囊再生与重建及损伤修复的相关调控因子⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．91．3．I胰岛素样生长因子⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。91．3．2表皮生长因子⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯101．3．3碱性成纤维细胞生长因子⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．101’3．4B．连环蛋白(13-catenin)及Wnt／13-catenin信号通路⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．111．4动物毛囊重建体外培养研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯121．4．1毛囊体外诱导再生研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯121．4．2毛囊真皮源性细胞对于体外毛囊诱导重塑的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯131．4．3动物毛囊体外培养与毛囊细胞分离培养的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯141．4．4建立动物毛囊体外重塑培养模型的研究前景⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯151．5本研究的目的与意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．162材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。162．1实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯162．1．1实验动物种群的维持与样品采集⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯162．1．2主要仪器设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．BO．O0．．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯162～13主要试剂及其来源⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．17 2．1．4培养液和常用试剂的配置⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．172．2试验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l92．2．1外根鞘细胞原代培养用细胞培养板的处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯192．2．2毛乳头细胞原代培养用细胞培养板的前期处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯192．2．3济宁青山羊次级毛囊的分离⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．192．2．4青山羊毛囊外根鞘细胞体外培养体系的完善⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯202．2．5济宁青山羊毛乳头细胞的体外分离与培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯212．2．6青山羊真皮成纤维细胞的分离培养及其细胞系的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．232．2．7青山羊毛囊体外重塑模型的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯263结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。273．1青山羊毛囊外根鞘细胞培养体系的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯273．1．1毛囊贴壁法培养外根鞘细胞的生长状态与形态学观察⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯273．1．2山羊毛囊外根鞘细胞Giemsa染色的观察结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一283．1．3传代培养的毛囊外根鞘细胞的生长特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯293．1．4山羊毛囊外根鞘细胞的染色体分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯293．1．5山羊毛囊外根鞘细胞免疫细胞化学鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．303．1．6毛囊外根鞘细胞的形态回复试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．303．2毛乳头细胞的分离培养与生物学特性检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3l3．2．1毛乳头细胞的形态学观察⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯313．2．2毛乳头细胞克隆形成率⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯323．2．3毛乳头细胞的种属来源及组织来源鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯333．3济宁青山羊真皮成纤维细胞的分离培养与鉴定⋯⋯。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。343．3．1原代外植法培养细胞的形态学及Giemsa染色的观察结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。343．3．2传代培养的真皮成纤维细胞的生长特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．353．3．3山羊真皮成纤维细胞的染色体分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯363．3．4微生物污染检测结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯363．3．5细胞活率与贴壁率的测定结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯373．3．6四种荧光蛋白质粒转染DFB效果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一373．4体外重塑毛囊组织培养体系的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯38 3．4．1体外重塑毛囊的生长形态观察⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯383．4．2体外重塑毛囊的组织学结构⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯393．2．3体外重塑毛囊与体内分离毛囊毛纤维生长速度的测定与比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．413．2．4体外重塑毛囊中关键基因表达量的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．424讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．434．1生长因子与激素对毛囊外根鞘细胞体外生长的调节作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯434．2培养体系中非毛囊外根鞘细胞的生长抑制与去除⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯444．3表面覆盖物(培养基质)对外根鞘细胞贴壁的促进作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯454．4山羊毛乳头细胞分离培养及其生物学特性的保持⋯⋯一：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯454．4．1山羊毛乳头细胞分离培养体系的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯454．4．20【．SMA在体外培养毛乳头细胞中的表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯464．5毛乳头细胞与毛囊外根鞘细胞的相互作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯474．5．1生长因子在DPC诱导ORSC中的作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．474．5．2体外培养基质对DPC与ORSC相互作用的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．494．6毛囊的体外三维重塑⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯514．6．1相关生长因子对体外重塑毛囊的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5l4．6．2培养液成分与体外培养基质对毛囊重建的作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯524．7山羊毛囊体外重塑模型成功建立的关键⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯545结论⋯⋯⋯．．⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯545．1优化了毛囊外根鞘细胞体外培养的技术体系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯545．2建立了毛乳头细胞高效分离与纯化技术及其培养体系⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．545．3建立了山羊真皮成纤维细胞系并完善建系方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯555．4建立了体外毛囊重塑培养模型并探索出毛囊重建的有效诱导条件⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯556参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯557致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。8攻读学位期间发表论文情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯64 山东农业大学博士学位论文中文摘要以济宁青山羊为动物模型，从毛囊细胞体外分离培养和体外毛囊重建研究角度阐明毛囊的生长发育规律、影响因素及毛囊真皮与表皮细胞的互作机制，不仅可为提高山羊毛绒产量和品质的育种改良奠定基础；还可为加速提高毛绒品质、数量和揭示毛发再生机理乃至医学领域的人类毛发研究等提供借鉴。毛囊细胞体外分离培养技术的完善，体外重塑毛囊模型的建立，可为研究毛囊生长与分化机制，相关细胞因子对皮肤毛囊细胞损伤修复的作用机理，尤其是哺乳动物毛纤维形成机制提供良好模型，也是研究相关细胞因子以及激素对毛囊发育、羊毛品质和黑色素形成与调控机理的基础。本研究在成功构建了多种山羊皮肤毛囊细胞体外分离培养鉴定技术平台的基础上，优化了适宜的培养方法和培养体系，成功构建了毛囊体外重塑模型与毛纤维体外生成体系，可为迸一步深入研究毛囊分化与发育的影响因素及其所涉及到的一系列生理现象，如皮肤毛囊细胞分化、真皮和表皮细胞间的互作、皮肤毛囊损伤和被清理机制等研究奠定基础。主要研究内容、方法和结果如下：一、山羊毛囊外根鞘细胞体外培养体系的优化无菌分离活体青山羊羔羊的次级毛囊，采用机械分离与酶消化相结合的方法，分离纯一的毛囊外根鞘细胞(ORSC)，培养于含有表皮生长因子(EGF)、类胰岛素生长因子．I(IGF．I)和氢化可的松(hydrocortisone)的无血清角质细胞培养液中，置5％C02浓度的37。C培养箱中启动原代培养。待原代细胞长成良好的单层后即可进行传代培养，细胞经传代培养至8～10代时，更换含EGF、IGF．I、氢化可的松和2％FBS的DMEM／F12培养液进行长期培养，更换培养液后可见细胞生长状态逐渐趋于稳定。选取稳定传代的OI塔C进行生物学特性研究与鉴定。结果表明：该细胞的群体倍增时间为51．9h；培养细胞的染色体数仍以2n---60为主，细胞免疫化学鉴定结果表明，外根鞘细胞角蛋白19表达呈阳性，证实本实验分离培养的细胞确为由毛囊干细胞分化来的外根鞘细胞。，j。、二、山羊毛乳买缅胞的分离培养与鉴定‘。⋯⋯一将中性蛋白酶与胶原酶消化及预铺设促贴壁培养基质相结合，分离并纯化山羊DPC，培养于含有表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和10％FBS的DMEM／F12培养液中，放入37"CC02培养箱中进行原代培养。待原代细胞长至完全汇合并进行传代培养后，更换含EGF、bFGF和2％FBS．的MEM与DMEM但12(1：1) 山羊毛囊细胞分离培养与鉴定及毛囊体外重塑研究复合培养液继续传代培养，更换培养液后可见细胞生长状态逐渐趋于稳定。选取稳定传至第7代的DPC进行生物学特性研究与鉴定。结果表明：该细胞的平均克隆形成率为60％，细胞增殖活力旺盛；培养细胞的染色体数仍以2n=60为主，细胞免疫荧光鉴定结果表明，体外培养的DPCa．SMA和Vimentin表达均呈阳性，充分证实本实验分离培养的细胞确为毛囊真皮源性的毛乳头细胞。三、山羊真皮成纤维细胞的体外培养及其细胞系的建立利用中性蛋白酶(dispase)4。C冷消化法分离皮肤的表皮层和真皮层，以利于纯化培养真皮成纤维细胞。然后，采用原代外植与酶消化相结合的方法，分离纯化的DFB：即先利用Dispase酶分离皮肤表、真皮层后，剪切真皮部分成组织小块，再对小组织块进行酶(胰蛋白酶)消化处理，随即将真皮外植块接种于6孔培养板底壁上。待贴牢后添加含有碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)、青霉素、链霉素、泰乐菌素(tylosin)和10％FBS的DMEM／F12培养液中，置5％C02浓度的37。C饱和湿度培养箱中启动原代培养。当培养板中的真皮外植块迁移出大量细胞时(约5~6天)，换为含有bFGF、青霉素、链霉素、泰乐菌素(tylosin)和5％FBS的DMEM培养液继续进行培养，每3天更换1次培养液。待原代真皮成纤维细胞生长至汇合时，进行传代，并于第一次传代时更换为25锄2培养瓶中培养，以利于真皮成纤维细胞在体外长期传代培养与冻存。本研究所建立的DFB细胞系已经稳定传至56代以上，其生长分裂状态良好，细胞遗传性状稳定。四、山羊体外重塑毛囊模型的建立和维持在无菌冰浴条件下，将鼠尾胶原、透明质酸、硫酸软骨素A按比例依次混合到MEM与DMEM／F12(1：1)复合培养液中，制成凝胶。调节pH后加入24孔板中。收获前期分离培养与鉴定的纯化毛乳头、真皮成纤维细胞，用含EGF、bFGF和5％FBS的MEM与DMEM／F12(1：1)混合培养液制成细胞混悬液，用无菌吸管将细胞混悬液加入24孔板中，待其在常温下形成真皮细胞胶原凝胶后，置于37。C、5％C02的饱和湿度环境中进行培养。每天在显微镜下观察DPC与DFB的生长增殖情况。待毛囊真皮细胞达到完全汇合后，表面覆盖预先制备的ORSC细胞混悬液，继续培养3～5天，观察ORSC于毛囊真皮细胞胶原凝胶上形成完整单层后，去除旧的培养液，加入少量(恰好覆盖表面ORSC细胞即可)含IGF—I、EGF的无血清角质细胞培养液，在37℃、5％C02的饱和湿度环境中进行气．液界面培养，每两天更换一次表层培养基。经显微观察拍摄、测微尺测量与实时荧光定量PCR检测，结果显示，在进行气液界面培养初期，毛乳头细胞即 山东农业大学博士学位论文呈现凝集性生长趋势，而表面的毛囊外根鞘细胞亦呈集落样散在分布于真皮成纤维细胞层中。随着气液界面培养的进行，毛乳头细胞迸一步凝集性生长，部分外根鞘细胞集落通过凝胶中的真皮成纤维细胞单层迁移聚集在毛乳头细胞团周围，并不断包绕，分化形成圆球样的类毛球结构贴附在真皮成纤维细胞层上。约经过10天的体外培养，由几种毛囊细胞形成的圆球状结构逐渐向外围拉伸扩张，内部的毛乳头细胞向一端迁移生长，最终由毛球样结构伸展延长成类毛囊结构，并有毛纤维从基部长出，部分生长出的毛纤维颜色为浓黑色，内含黑色素。各检测数据显示，体外重建的毛囊结构与体内正常毛囊比较无论在组织结构、毛纤维生长速度，还是毛囊发育关键基因的表达调控方面，均差异不显著。本研究优化并建立了山羊毛囊细胞体外培养条件和体系，研究了细胞因子对毛囊真皮表皮细胞的影响，成功建立了山羊毛囊体外诱导重建体系，为揭示山羊毛囊分化发育与羊毛生长的影响因素和调控机理奠定了基础和提供了模型；并为医学研究和发现毛发疾患病因、探讨药物治疗作用机理等提供了借鉴。本研究所涉及的细胞因子和培养条件等，多数反映了一般实验条件下这些常见因素的互作，期望能为人类毛发再生和脱发问题研究提供借鉴。关键词：济宁青山羊；毛囊重塑；外根鞘细胞；毛乳头；细胞因子 山羊毛囊细胞分离培养与鉴定及毛囊体外重塑研究StudiesonIsolation，CultureandIdentificationofHairFollicleCellsofGoatandReconstitutionofHairFollicleinVitroAbstractTakingJiningGreygoatsasanimalmodels，clarifiesthegrowthregularofhairfollicle，impactfactorsandtheinteractionmechanismofhairfollicledermalcellsandepidermalcellsfromisolationandcultureofthehairfolliclecellsandreconstitutionofhairfollicleinvitro．NotonlytolaythefoundationforimprovingthequalityofthebreedingimprovedofCashmerequality,butalsotoofferreferenceforimprovingthewoolquality,quantity,qualityoffurpatternandhumanhairresearchinmedicalarea．Improvementtechniqueofisolatingandculturingthehairfolliclecells，constructingreconstitutionmodelofhairfolliclesinvitroCanlaythefoundationforfurtherstudyinhairfollicledifferentiationanddevelopment，mechanismofcellfactorsonhairfolliclecellinjuryandskincellrepair,mechanismofthecellfactorsandhormoneonfollicledevelopment，woolqualityandmelaninformationandregulation．Thepresentstudybasedonthesuccessfulconstructionoftheplatformoninsolation,cultureandidentificationofavarietyofskincellsandhairfolliclecellsfromgoatinvitro，screeningtheoptimumculturemethodsandsystemandbuildingcelllineimpactfactorsandinvolvedmanyphysiologicalphenomena,suchasskinandhairfolliclescelldifferentiation,interactionbetweendermalandepidermalcell，mechanismonskinandhairfollicledamageandcleaning．I．Improvementofouterrootsheathcellsculturesystemfromgoathairfollicleinvitro．Adoptingenzymedigestioninconjunctionwithmechanicalmethodssterileisolatesentirehairfollicle，thepurifiedORScellswereculturedinserum—freekeratinocytemediumcontainingepidermal+growthfactor(EGF)，insdin-likegrowthfactor-I(IGF-I)andhydrocortisone．Theceilswereincubatedina5％c02atmosphereat37"Cinthestartofprimaryculture．TheORScellsweresplittosubcultureswhentheprimarycellsformedgoodmonolayer．ORScellsweresubeulturedto8thto10thpassages，themediumWasreplaced、vi廿1DMEM／F12mediumcontainingEGF,IGF—I，hydrocortisoneand2％FBSforthelongtermculture．Thecellsshowedgraduallystabilizedgrowthafterchangingthemedium． 山东农业大学博士学位论文DetectedandidentifiedthebiologicalcharacteristicofORScells．111eresultsshowthattheculturedcellspopulationdoublingtimewas51．9h，chromosomenumberisstilldominatedby2n=60．Theresultsofimmunocytochemicalstainingshowedthatthecytokeratin19expressionwaspositive，provedthattheculturedcellsisouterrootsheathcellsfromhairfolliclestemeelldifferentiation．II．Isolationandidentificationofdermalpapillacellsfromgoat．111edispasecombinedwithcollagenasedigestionandlayingofadherentculturematrix，separationandpurificationofDPcells，culturedinDMEM／F12mediumcontainingepidermalgrowthfactor(EGF)，basicfibroblastgrowthfactor(bFGF)and10％FBSinprimaryculture．Whentheprimarycellswerecompletelyconfluentsubcultured，themediumwasreplacedwithMEMandDMEM／F12withEGF,bFGFand2％FBS(1：1)compositemediumtocontinuetosubculture．Thecellsshowedgraduallystabilizedgrowthafterchangingthemedium．TheDPcellsat7thpassagewereselectedtostudyonbiologicalcharacteristicsandidentification．111eresultsshowthattheaveragecloningefficiencyofcellis60％，suggestthecellsproliferationvitalitywereluxuriant．Theresultsofchromosomalanalysisindicatedthatmajorityofthecellswere2n=60．Theresultsofimmune-fluorescenceshowedthattheexpressionofa—SMAandV'tmentinwerepositiveinDPCandfullyconfirmedthesubeulturedcells．11圮resultsprovedthatthedermalpapillacellswerehairfollicledermalsource．III．Cultureofdermalfibroblastsfromthegoatandestablishmentofthedermalfibroblastcellline．nemethodof4"Cdispasecolddigestionwasusedtoseparatetheskinepidermisanddermis，inordertoculturethepurificationofdermalfibroblasts．Then,adoptingtheprimaryexplantcombinedwithenzymedigestionseparatedandpurifiedDFB．Atfirstdispasewasusedtoseparateepidermisanddermisfromskin，andthesteriledermalpartwasgentlymincedintosmallpieces．Thesmalltissuepieceswereenzymebytrypsin；and。thendermalexplantswereseededonthebottomof6一wellplates．DMEM／F12medium、析mcontainingbasicfibroblastgrowthfactor(bFGF)，penicillin,streptomycin，tylosinand10％FBSwasaddedtoeachwellofthe6-wellplatesafterthepiecesattachedfirmly．TheceHswereincubatedina5％C02atmosphereat37℃inthestartofprimaryculture．Whenalargenumberofcellsweremigratedoutfromcultureddermalexplant(about5·6days)，theV 山羊毛囊细胞分离培养与鉴定及毛囊体外重塑研究mediumwasreplaced、)I，itllDMEMmediumcontainingbFGF,penicillin，streptomycin，tylosinand5％FBStOsubculture，themediumWasreplaceevery3days．Thecellswerereplacedtothe25cm2flasksatthefirstpassagetimewhentheprimarydermalfibroblastsweregrowntoconfluency，infavorofdermalfibroblastsculturedlongtermsubcultureandcryopreservationinvitro．ThestableDFBcelllineWasestablishedinthisresearchhassubculturedtothe56passages，andthegrowthandproliferationofcellswereingoodcondition，geneticstability．IV．Establishandmaintainthereconstitutionmodelofhairfollicleinvitro．Inthesterileicebath，therattailcollagen，hyaluronicacidandchondroitinsulfateAweremixedproportiontoMEMandDMEM／F12(1：1)compositemediumtomakeofgel，andthenaddedto24-wellplatesafterregulatedpHofthegel．Thepurifieddermalpapillacellsanddermalfibroblaststhatwereisolatedandidentificatedtheearlystagewereharvest，thecellsweresuspendedbyMEMandDMEM／F12containing5％FBS(1：1)compositemedium．SterilecellsuspensionWasaddedin24-weUplates，formedthedermalcellcollagengel．ThecellcollagengelWasincubatedin37*(2and5％C02humidityenvironmentalconditions．ThedailygrowthandproliferationofDPCandDFBwereobservedundermicroscope．Whenthehairfollicledermalcellsreachedcompletelyconfluence，preparedORScellsuspensionaddedthesurface，culturedfor3-5days．ObservedORScellsinthehairfollicledermalcellcollagengeltoformacompletemonolayer,removedtheoldmediumandaddedasmallamountK-SFMOustcoveredthesurfaceofORScells)containingIGF·I，EGFat37*(2，5％C02saturatedhumidityofgas-liquidinterfaceculture，replacedthesurfacemediumeverytwodays．Throughmicroscopicobservation，micrometermeasurementandreal-timefluorescencequantitativePCRdetection，theresultsshowthatdermalpapillacellspresentagglutinativegrowthtrendinthegas—liquidinterfacecultureearly,butthehairfollicleouterrootsheathcellsandscatteredcoloniesinthedermalfibroblastlayer．Withthegas-liquidinterfaceculture，dermalpapillacellsfurtheragglutinativegrowth，partoftheouterrootsheathcellscolonybygeldermalfibroblastmonolayermigrationgatheredaroundthedermalpapillacells，andconstantlysurrounded，differentiateintoballkindoftypeofhairballstructureattachedtothedermalfibroblastcelllayer．Sphericalstructureformedbyseveralhairfolliclecellsgraduallytoperipheraltensionexpansionafter10daysofcultureinvitro，dermalpapillacellstoendV 山东农业大学博士学位论文internalmigrationgrowth，andultimatelybythehairbulbstructureextensionalextendintotheclassstructureofhairfollicle，andhairyfibersfromtheradicalminister,woolfibercolorpartofthestudentstogrowasthickblack，withblackpigment．Thetestingdatashows，invitroreconstructionofhairfolliclestructureandnormalhairfolliclesarebothintheorganizationalstructure，woolgrowthrate，thekeygeneandhairfollicledevelopmentregulationofexpression，thereisnosignificantdifferences．Thisstudyestablishedandoptimizedconditionsandculturesystemofhairfolliclecellsinvitrofromgoat．Studiedtheeffectsofimpactfactorsonhairfollicledermalcellsandepidermalcells，successfullyestablishedareconstructioninductionsystemofhairfollicleinvitrofromgoat．Thisprovideanimalmodelsandlaythef0啪da缸0nforpeopletorevealtheandregulatorymechanismofdifferentiationanddevelopmentofgoathairfollicleandwoolgrowth；providesareferenceformedicalresearchanddiscoverycauseofhairdisorders，themechanismofsuchdrugtreatment．Relatedfactorsinvolvedinthisstudyandthecultureconditionsreflectthemostcommoninteractionsamongthesefactorsintheexperimentalconditions，providereferenceforhumanhairregenerationandcanitiesresearch．Keywords：JiningGreygoat；reeonstitutionofhairfollicle；outerrootsheathcell；dermalpapilla；cellfactorV¨ 山东农业大学博士学位论文1引言毛囊的发育与再生对山羊毛产量和羊绒品质等都有直接影响。毛囊(hairfollicle)是表皮向真皮凹陷后形成的能控制毛发生长的皮肤附属结构，是由胚胎期神经外胚层与问充质相互作用，最终发育形成的由多层细胞组成的、具有合成多种特异角质蛋白功能的复杂的动态器官。在哺乳动物的一生中，毛囊反复周期性地经历着生长期、退行期和休止期的变化，并通过周期性的生长，显示出完全的自我再生能力。毛囊的这种周期性变化受多种因素的影响和调控，毛囊的周期性变化也决定着毛发的分化和生长速度。而毛囊由休止期向下一个生长期的发育过程，又与毛囊的胚胎发育过程有着很高的相似性，最初均由真皮细胞发出初始信号，诱导表皮形成毛芽，随后毛芽释放相关生长因子，作用于具有分化潜能的真皮成纤维细胞，使其呈凝集性生长，逐渐形成毛乳头，毛乳头再释放次级信号，促进毛囊上皮细胞增殖、分化形成完整的毛囊结构(Matsuzakieta1．，1998)。可见，毛囊的发育、分化与再生是一系列真皮细胞与上皮细胞相互作用的结果。其中，毛乳头细胞(dermalpapillacell，DPC)与外根鞘细胞(outerrootsheathcell，ORSC)作为重要的毛囊真皮与上皮细胞，二者的相互作用及其所涉及的细胞因子和受体，形成固有的信号通路，在毛发的生长分化、再生、损伤、毛囊修复、初级毛囊和次级毛囊发育等生理过程中发挥着重要作用(Stenneta1．，2001；Oshimaeta1．，2001)。因而，针对DPC与ORSC互作机制问题的相关研究越来越受到高度关注。由于体内影响DPC与ORSC互作的因素过多并且无法进行全面了解与精确控制。因而，在体内研究和揭示毛囊真表皮细胞互作对毛囊生长发育规律的影响存在许多困难，为避免体内复杂因素的干扰，建立良好的毛囊体外重塑培养模型对阐明毛囊的生物学特性非常重要。尤其是山羊毛囊体外三维重建培养技术的建立，成为体外研究毛囊生长与分化，毛囊损伤的修复愈合，毛纤维生成与延长等问题的良好模型，也是研究相关细胞因子以及激素等对毛囊发育、毛干生长速度品质与形态、黑色素形成与调控机理的基础，从而为进一步提高羊毛和羊绒_质量与羊毛产量提供基础性研究数据。本研究以济宁青山羊为动物模型，从毛囊细胞体外分离培养和体外毛囊重建等角度深入研究毛囊的生长发育规律、影响因素及毛囊真皮与表皮细胞的互作机制。济宁青山羊是世界著名的羔皮山羊品种，原产于我国鲁西南济宁、菏泽地区的二十余个县，具有性成熟早、繁殖率高、耐粗饲的特点。其主要产品有青猾皮、羊绒等。青猾皮是济宁青 山羊毛囊细胞分离培养与鉴定及毛囊体外重塑研究山羊出生后1～3日内宰剥的羔皮，以独特的天然毛色和花型驰名海内外。青山羊的毛被由黑、白二色的羊毛组成，两者以不同比例混合，使毛被呈现正青色、铁青色和粉青色三种颜色。黑毛的色度与黑素细胞的发育有关。黑毛和白毛的长度、直径和弯曲度等也影响毛被的花形和色度。毛皮的花型可分为波浪状、流水状、片花和隐暗花四种，另外还有平毛，即毛直无弯曲者，这都与毛囊细胞的生长发育密切相关。此外，成年青山羊年产绒量50～709，绒长3,--4em，羊绒平均细度为12．81un。青猾皮与羊绒一直是我国传统的出口产品，在国际市场倍受青睐。毛囊是一个由多层细胞组成的特殊器官，在动物的一生中反复经历着生长期、退行期和休止期的周期性地循环变化，具有独特的结构和旺盛的自我再生与重建能力。在组织细胞水平上揭示山羊毛囊发育与毛纤维再生重建机理及其影响因素可为提高毛绒产量和品质奠定基础，本研究在前期体外培养的游离毛囊细胞及成功建立毛囊外根鞘细胞系的基础上，采用动物器官型培养、细胞转染、定量PCR、组织切片、细胞与免疫组化等分子细胞生物学技术，进一步探明毛囊再生与损伤修复的机理和揭示毛囊真皮与表皮细胞的互作机制，探明黑色素形成的诱导因素和机理，这可为培育高产毛量的绒山羊和提高毛绒品质奠定基础；还可建立起一套毛囊发育与毛发再生的体外器官培养模型，以揭示小肽类、激素类、细胞因子及体外培养基质等各种理化因素对皮肤毛囊发育和病变的影响；揭示白发产生的诱因及其影响因素，初步比较研究促毛囊生长因子与激素在毛发再生与毛干生长过程中的作用，并为人类脱发、斑秃、白发和秃顶的治疗提供重要参考。1．1山羊的毛囊结构与济宁青山羊毛皮品质1．1．1山羊的毛囊结构毛囊是哺乳动物皮肤中重要的附属结构复杂，它由包在毛根外面的上皮组织和结缔组织鞘构成(图1．1)。毛囊下端与毛根合为一体，膨大为毛球。毛球是毛和毛囊的生长点，其上皮细胞为干细胞，称毛母质。。它们不断增殖分化，向上移动，形成毛根和上皮性鞘的细胞。毛球底面有结缔组织突入其中形成的毛乳头，内含丰富的毛细血管和神经末梢，毛乳头通过控制毛母质细胞的数目而控制毛发的大小和形状。毛干和毛根由排列规则的角化上皮细胞组成，细胞内充满角蛋白并含有黑素颗粒。毛囊分为两层，内层为上皮性鞘，包裹毛根，与表皮相连续，其结构也与表皮相似；外层为结缔组织性鞘，由致密结缔组织构成。内外两层中包含有20余种细胞，包括角质形成细胞、黑色素细胞、 山东农业大学博士学位论文外根鞘细胞和毛乳头细胞，这些细胞在体内经过复杂的相互作用，共同参与毛囊的发育、生长、分化与周期性调节(MillaetaL，2002；PauselaL，1999)。图1-1济宁青山羊毛囊结构图(崔志峰，2008)Fig．1-1HairfolliclestructuralpattemofJiningGreygoats(Zhi-fengCui，2008)1．1．2济宁青山羊的毛皮品质济宁青山羊是我国著名的羔皮山羊品种，原产鲁西南的济宁和菏泽两地区的二十余个县。所产青猾子是济宁青山羊羔羊生后1-3天内宰剥的羔皮，以天然花色驰名海内外。青猾皮的毛由黑、白二色的毛组成，毛被毛色分正青色、铁青色和粉青色三种。两种毛的长度比也影响毛被的色度。毛皮的花型可分为波浪状、流水状、片花和隐暗花四种，另外还有平毛，即毛直无弯曲者(尹逊河等，2002；蒋英等，1998)。1．2动物毛囊的生理特性及功能1．2．1动物毛囊的生长周期毛囊产生动物毛发纤维的过程具有周期性，一般分为三个阶段：生长期(anagen)，亦称活跃期，此期毛球部细胞增生活跃，分化成毛发各部分的前体细胞；退化期(catagen)，毛发前体细胞形成中止，毛球部迅速退化；休止期(telogen)，是毛发循环的相对静止阶段。以上三个阶段互相交替，形成了毛囊的周期性循环(BotchkarevnetaL，2003)。毛囊周期性生长的机理目前尚不完全清楚，主要存在如下学说：(1)表皮学说(epithelialtheory)：在毛囊隆突部位的细胞控制着毛囊周期；(2)毛乳头形态发生学说(papillamorphogenesistheory)：毛乳头通过周期性表达和释放生长相关因子来控制毛囊周期(JahodaetaL，2001)；(3)隆突激活学说(bulgeactivationtheory)：毛乳头产生的生长因子通过隆突部位的干细胞来调控毛囊周期(Ducloseta1．，1999)；(4)共谐学说(resonancetheory)：毛囊周期受毛囊各成分细胞共同作用产生的生物钟所调控；≈ 山羊毛囊细胞分离培养与鉴定及毛囊体外重塑研究(5)胚胎周期学说(inherentembryoniccycletheory)：毛囊周期的生物钟是在胚胎形成中建立并可持续终生(Opsahleta1．，1997)；(6)抑制一去抑制学说(inhibitiondis．inhibitiontheory)：在毛囊生长周期中，一种内源性的有丝分裂抑制剂逐渐积聚于隆突部，当其达到一定浓度时，毛囊细胞的生长即停止，而在休止期，其浓度降低到一定程度，毛囊又重新开始生长(Cotsareliseta1．，1998)。应该注意的是，毛囊周期(haircycle)的假说包括了周期的特点、真皮和表皮间相互作用、不同部位毛囊的差异及其对许多毛囊外生长调节因子的敏锐感受力，如激素、生长因子、营养改变等，从生长期开始，毛囊经历退行期、休止期，所有躯体的毛发均显示这种周期，但不同毛囊的周期、同一周期的不同阶段以及每个毛干的长短依部位而大为不同。在人类和豚鼠，每个毛囊有其自身内在的节律，所以每个毛囊周期都是不同的，而在大多数哺乳动物，因大多数毛囊周期都一致，可出现周期性地脱毛，毛囊的这种内在节律，可受临近毛囊或系统(如激素)刺激的影响，所以尽管毛囊周期是内在的、自发的，但它也可受外界系统和局部因子的影响(Ozekieta1．，2002)。目前尚不清楚毛囊的生物钟中心是存在于表皮还是真皮，或先与毛囊周围环境中因子共同作用的结果。最近的研究工作提示，毛囊周期可能是毛囊各成分细胞共同作用的结果。1．2．2动物毛囊的细胞组成及功能成熟毛囊形成过程中至少涉及到20余种不同的细胞群，主要由属于细胞间质成分的毛乳头(dermalpapilla)和真皮鞘(dermalsheath)；属于上皮成分的内根鞘(interrootsheath)和外根鞘(outerrootsheath)等组成(图1．2)。图1-2动物毛囊的细胞组成与分布(CotsarelisG2007)Fig．1-2Compositionanddistributionofhairfolliclecells(CotsarelisG2007)1．2．2．1毛乳头细胞(dermalpapillacell，DPC)4 山东农业大学博士学位论文毛乳头细胞来源于成纤维样细胞(fibroblast)，为了使毛囊定向分化和生长，毛乳头细胞的形态，生化和功能发生了一系列变化，形成了与成纤维样细胞完全不同的一类细胞(Nanbaeta1．，2003)。毛乳头细胞和真皮成纤维细胞的主要区别有以下几个方面：(1)细胞形态扁平，呈多角形，以后增加到一定数量则呈多层凝集团，连续5代均有凝集性生长的特性；(2)毛乳头细胞增生活性比真皮成纤维细胞明显低，毛乳头细胞的最大增值活性表现在接种后的第4~7天，而真皮成纤维细胞则在接种后的2～5天；(3)毛乳头细胞对Ⅳ型胶原的粘附能力强；(4)毛乳头细胞凝胶收缩能力低，并且溶解胶原；(5)毛乳头细胞合成并表达较高的洳整合素。培养的毛乳头细胞表达a．平滑肌肌动蛋白，同时也表达多种细胞因子及其受体，包括干细胞生长因子(stemcellfactor，SCF)、血管内皮细胞生长因子(vascularendotheliagrowthfactor，VEGF)、肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)、胰岛素样生长因子(insulin．1ikegrowthfactor，IGF)及胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin．1ikegrowthfactorbindingprotein，IGF-BP)、角质形成细胞生长因子(keratinocytegrowthfactor，KGF)、成纤维细胞生长因子受体(fibroblastgrowthfactorreceptors，FGFR)和雄激素受体(androgenreceptors，AR)。这些因子均与毛囊的生长发育及周期性有关。1．2．2．2真皮成纤维细胞(dermalfibroblast，DFB)真皮成纤维细胞是构成皮肤真皮组织的主要细胞，其正常的增殖分化对于皮肤生理机能调控、伤口愈合及组织工程皮肤重建等方面均发挥着重要作用。在皮肤组织中，真皮成纤维细胞能够分泌表皮生长因子(E(陋)、血管内皮生长因子(VEGF)和转化生长因子．p(TGF．p)等多种生长因子，他们作用于表皮细胞、血管内皮细胞以及毛囊相关细胞，可诱导表皮形成，加速血管生长，调控毛囊生成与周期性再生。此外，真皮成纤维细胞还能够为其它细胞提供胶原蛋白、弹性蛋白等多种细胞外基质。这些细胞外基质作为真皮结构的重要组成部分，对皮肤正常结构维持、其它皮肤细胞的粘附以及毛囊等皮肤附属器官形态保持均具有重要作用。近年来研究发现，体外培养的真皮成纤维细胞中可分离得到真皮干细胞，该干细胞可在特定诱导条件下分化生成脂肪细胞、肌细胞、软骨细胞、黑素细胞以及毛乳头细胞等多种其它组织细胞(Philpotteta1．，1990)。同时，DFB因具有易于培养、增殖快速、形态和生物学特性相对稳定等特点，可为遗传资源保护、基因组文库构建、体细胞克隆、基因遗传多样性研究等领域提供理想的生物学材料。 山羊毛囊细胞分离培养与鉴定及毛囊体外重塑研究1．2．2．3外根鞘细胞(outerrootsheathcell，ORSC)外根鞘细胞分化为终末细胞的类型取决于其在毛囊中的位置。外根鞘细胞增生在生长期开始受到刺激，但在伤口愈合过程中，通过上部或下部上皮再生得到补充。山羊毛囊的外根鞘细胞直接与DPC培养，在毛乳头细胞上或细胞之间的基质上生长很好，DPC能促进外根鞘细胞(ORS)的分裂，但生长方式不像毛发生发细胞那样紧密地生长，而在基质上成铺路石样(Po．Lineta1．，2004)。直接在毛乳头细胞上的外根鞘细胞呈小圆形，二周后细胞数不再增加，四周后死亡，ORS与DPC之间没有复杂的结构形式，两者之间界面不规则，有一些突起与DPC相连。1．2．2．4毛母质细胞(hairmatrixcell，MAC)毛母质细胞可具体分成2种类型细胞，一种类型细胞在毛发生长期中增生，分化形成毛发纤维；另一种细胞不分化，被称之为生发上皮细胞。当外力拨出毛干和部分毛母质后，生发上皮细胞留下，只要毛乳头完整，在毛乳头的诱导下，生发上皮细胞可增殖分化再形成完整的毛母质和毛发纤维。单独培养的毛母质细胞不增殖，当加入有活性的毛乳头细胞，生发上皮细胞开始增殖，并表现出复杂的相互作用，包括形成基底膜。这些发现有广阔的生物学用途，拓宽了毛囊细胞研究的思路，特别是与毛乳头细胞相互作用形成的复杂结构，如毛囊的玻璃膜。1．2．2．5毛囊干细胞(hairfolliclestemcell)毛囊干细胞一直被认为是存在于毛囊末端毛球基底部的生发细胞，因为在毛囊生长期，这种生发细胞可分化形成至少7个不同的细胞系，包括髓质、皮质、毛小皮、Huxley’S层和Henle’s层等。根据干细胞的特点有二个方面支持生发细胞是毛囊干细胞：(1)生发细胞在每一个生长期均形成新的毛发纤维，而在每一个休止期又失活；(2)生发细胞在每一个周期结束时丢失或被破坏，而在下一个周期开始时，又被ORS细胞取代。在胚胎期，毛囊内原基的三个隆突部：漏斗部的突起发育成汗腺(sweatglands)；漏斗部和峡部交界处的突起发育成皮脂腺(sebaceousglands)；第三个突起在干组织与峡部的连接处，是毛囊上皮的起源。在毛囊生长周期的休止期末给予秋水仙碱，则在下一个周期的生长早期的毛囊，只有隆突部存在有丝分裂相，其它部位被抑制。一般而言，干细胞具有无限增殖的能力。每次分裂后的一个子细胞将离开干细胞的原位而成为短暂分裂细胞，这种细胞是一种增殖潜能有限的细胞，最终会衰竭而变成终未分化细胞，生长期的长短是毛母质内在特征所决定的(Maeta1．，2004)。干细胞的活化与毛乳头细胞 山东农业大学博士学位论文有关。在退行早期，毛乳头收缩，与退化毛母质之间距离增大。在静止后期或生长早期，在外根鞘和结缔组织鞘的作用下，毛乳头受力上移并靠近隆突部，此时毛乳头细胞开始分泌细胞外基质及细胞因子或在毛乳细胞的直接作用下，隆突部的正常慢循环干细胞被激活并增生，毛囊得以向下生长，并推动毛乳头离开隆突部，这样隆突部的干细胞又恢复到静止的慢循环状态，此时己进入毛囊生长中期。1．2．3毛囊的组织分化与发育毛囊是表皮向真皮凹陷后形成的能控制毛发生长的皮肤附属器官。在胚胎毛囊发育过程中，凝集的真皮成纤维细胞诱导了毛囊的形态学发生。毛囊的形态发生大约经历形成毛芽、毛乳头、毛囊结构与毛腔、出现胎毛等4个阶段。在这4个阶段中，上皮(毛母质与外根鞘)和真皮(毛乳头和结缔组织鞘)所包含的如角质形成细胞、黑素细胞、Langerhan’S细胞、Merkel’s细胞、真皮鞘细胞、毛乳头细胞等20余种细胞经过复杂的相互作用共同参与了毛囊的发育、生长。首先由间充质细胞发出初始信号，诱导上皮形成毛芽；毛芽再释放一些因子诱导间充质形成毛乳头；毛乳头释放第二种信号刺激上皮细胞增生，分化形成毛囊结构(Liangeta1．，1994)。1．2．3．1毛囊的发育毛囊是由表皮下陷生成的一种上皮性结构，首先由表皮生发层局部增生，形成一向下突入间充质的上皮细胞柱，称毛胚芽(hairgerm)。此芽斜向下生长，每一芽的终端下方有一群问充质细胞聚集，即为未来的毛乳头。毛胚芽最深部细胞由于间充质的诱导作用而迅速增生，形成毛球，毛囊即由毛球及其上方与表皮相连的上皮细胞柱构成。随着胚胎发育，毛球下方的间充质突入毛球，生成毛乳头(Guoeta1．，1996)。毛乳头的间充质与毛囊周围的间充质相连续，毛囊周围的间充质分化成毛囊的结缔组织鞘。毛母质细胞不断增生，向上产生出一锥形的幼稚细胞团，称为毛锥(haircone)。毛锥通过毛囊中央向表面推进，其周围的毛囊细胞构成上皮性的内根鞘，毛囊壁外周的细胞形成外根鞘。毛母质增生所形成的毛锥细胞逐渐变扁并角化，分化成毛的皮质(cortex)、髓质(medulla)和最表面的毛小皮(haircuticle)。随着毛的形成和向上生长，由神经脊迁移来的黑色素细胞侵入毛球，逐渐使毛色变深，毛增长并突出毛囊，出现于表皮上方。当毛发分化时，在斜行的毛囊钝角侧出现两个增生区，上一个为皮脂腺原基，下方一个贴近毛乳头，称为上皮芽(epithelialbud)，下方增生区迅速增生，使毛囊不断变长(Cotsareliseta1．，1990：Magerleta1．，2001)。毛囊周期性的增生、静止与退化，从而造成毛发周期性的脱落与再生。 山羊毛囊细胞分离培养与鉴定及毛囊体外重塑研究1．2．3．2初、次级毛囊的组织分化山羊真皮层在胚胎发育时，39"--'48日龄时已有，管壁由单层扁平内皮组成的微血管和淋巴管，真皮内有大量的菱形间充质细胞，乳头层和网状层没有明显的分界，到75日龄时头部真皮分化出乳头层和网状层；45日龄时初级毛囊原始体己经出现，60日龄各部位均有初级毛囊原始体，颈、背、臀部的毛囊原始体增多，并已开始向真皮层伸入，形成一个管状物；75日龄时初级毛囊管状物继续向真皮伸入，在初级毛囊一侧出现皮脂腺和汗腺，次级毛囊已经发现并开始发育：90日龄，有些间充质细胞向成纤维细胞转化，并有少量结缔纤维发生。初级毛囊继续向真皮伸入，毛球开始形成，毛囊内有毛纤维发育，出现竖毛肌；初级毛囊进入网状层并形成毛囊群，粗毛长出体表，出生时，所有的初级毛囊都已发育成熟，次级毛囊继续发育，到出生六个月基本发育成熟。1．2．4山羊毛囊形态发生的过程毛囊的形态发生是一个精细的调控过程，它的位置、极性和分化模式受到位于表皮细胞和问充质细胞的抑制物和激活物的互作调节。一旦成纤维细胞诱导间充质细胞浓缩物形成，它就控制毛囊形成过程的后续步骤，并且控制毛囊干细胞分化为不同的细胞系。整个过程涉及大量生长因子、受体、拮抗物等细胞内信号传导分子的表达。从动物出生后获得的实验数据表明，表皮毛囊特异性分化的程序是从接收到间充质细胞的第一个信号开始的。毛囊的形成过程从形态上可划分诱导期、器官形成期和细胞分化期3个时期，现分述如下：(1)诱导期：上皮组织未分化，刺激物和抑制物的互作梯度在上皮和真皮之间建立诱导场，随后由表皮基底层的一个点增厚开始，局部基底层细胞向真皮内部突出形成毛芽，在增厚表皮的下面，真皮细胞在特定的位置增加密度并形成一个细胞丛；(2)器官形成期：次期特征为毛芽继续向真皮深层伸入，形成一个实性的柱状结构，其末端包围有更多的真皮成纤维细胞，形成一个类似“帽子”的结构。随后柱状结构进一步深入到真皮中，并且表皮细胞开始覆盖间充质细胞，形成球状细胞丛即毛球，随着胚胎发离毛球内凹，形成毛乳头和连接组织鞘。毛基质细胞开始快速的分裂并向上迁移，内根鞘和毛干分化，此时出现内根鞘的Herde’S层。在毛囊的末梢，可以看到第1个皮脂细胞，在毛囊的上部，可以看到黑色素颗粒和毛干，毛乳头基本上被毛基质细胞围住，形状近似圆形，内根鞘、外根鞘和毛干已经形成，毛囊基本形成完整结构；(3)细胞分化期：毛囊继续伸长，达到网状层的深部，毛乳头变细，呈椭圆形，以后随日龄增长，毛囊逐渐发育成熟。分化中的毛干顶部到达真皮皮下组织边界。在毛 山东农业大学博士学位论文囊的末端，可以看到毛乳头与血管连接的开口通道，毛乳头呈橄榄球形，当毛囊伸长到最大长度，可看到近侧端毛球深入到皮下组织中；在真皮中可看到皮脂腺和竖毛肌，毛囊的发育已经基本完成(Maurereta1．，1998)。毛乳头在毛囊形态发生调控中处于中心环节，通过调控毛基质细胞的生长分化来控制毛发的粗细、长短和形状。毛乳头深入到毛球中，毛球快速增殖的角质化细胞向上迁移，并分化成内根鞘，内根鞘细胞是毛囊中第一个停止分化的上皮细胞。1．3毛囊再生与重建及损伤修复的相关调控因子在成熟哺乳动物中，毛囊是唯一保留形态发生能力和具有自我再生的结构，毛囊在其周期中可以进入休止期，并可在适当的信号后重新自我形成。研究显示，细胞间信息交流多借助于信号转导分子(通常是一些短肽或小分子蛋白)、可溶性分子(细胞因子)或细胞表面受体。毛囊的生长调控可能也借助于细胞间信号转导，在毛囊生长调控中，这些分子的作用包括：(1)借助受体的信号分子可引起特定配体的特定表达；(2)配体或受体的特定表达可导致某一功能的发挥；(3)一个信号可能诱导毛囊的形态发生，或刺激其他信号分子的产生，反过来引起表皮间、表真皮问和真皮问相互作用的增强。成功的研究有赖于理想的实验模型，之前用于毛囊研究的模型主要有动物模型、器官培养体系、细胞培养体系及转基因动物。目前，在动物模型上已经发现多种蛋白及基因参与毛囊生长的调节。Stenn等将可能对毛囊周期及其生长有密切影响的分子作了简要归纳(Stenneta1．，1999)。这些蛋白及基因家族常由不同水平的同源成员组成，如相关的配体、细胞膜受体、细胞间质内转导信号和核转录因子等。它们之间的相互问作用非常广泛，能与毛囊周期中的许多信号转导途径产生相互作用，这些分子间的相互作用反映了毛囊真表皮间的信息交流。值得注意的是，毛囊具有发挥调节毛发生长功能的多种途径，VEGF的作用就是一个很好的例子，缺少它时，生长期可以暂时而不是永久延误，这提示还有其他能诱导毛囊进入生长期的分子。现就对毛囊培养以及毛囊生长有较重要影响的生长因子及细胞因子作一概述。。‘‘1．3．1胰岛素样生长因子胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor，IGF)对毛发生长的调控作用越来越引起人们的重视，IGF—I和胰岛素具有一定的结构同源性，可有效促进有丝分裂的活性，促进蛋白质的合成，并且能够刺激黑素细胞、上皮细胞和毛乳头细胞等各种细胞增殖和分化，具有胰岛素样代谢作用。IGF．I存在于毛囊细胞中，在毛囊的生长发育中，IGF—I9 山羊毛囊细胞分离培养与鉴定及毛囊体外重塑研究以旁分泌或自分泌的方式由间充质细胞产生，生理剂量的IGF．I对正常毛发的生长发育是必需的，IGF．I阻止毛囊进入休止期，是毛囊生长和毛囊生长周期的生理调节剂，可以调控毛囊生长期至退行期的转换。IGF—I刺激毛囊生长的作用源于在不同生长周期调控上皮角化细胞的增殖和分化，减少毛囊细胞的凋亡。IGF．I受体(IGF．IR)具有调节IGF．I信号功能，IGF—I通过其受体间的细胞信号途径，来刺激毛囊细胞的增殖。IGF．IR存在于毛囊内外皮根鞘和毛球基质细胞等有增殖潜力的上皮细胞表面，在山羊毛囊的生长周期中，在生长末期和休止初期发现IGF．IR表达显著下降，表明毛囊进入休止期的潜在信号是IGF．IR表达下降，而且IGF．I通过诱导上调5a．还原酶，调节雄激素在毛囊中的作用。IGF～与IGF．IR结合起旁分泌和自分泌作用，对毛发的生长发育和周期起调控作用。IGF．I与结合蛋白(BPS)作用能维持毛发生长初期和刺激毛囊增殖，并调节躯体生长激素的分泌。BPS控制着IGF．I的运输及与细胞表面的受体结合，但IGF．I对毛发生长调控的精确机制还有待于进一步研究。1．3．2表皮生长因子表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)是细胞周期的外源性调节因子，能加速细胞周期进程。EGF也是一种多功能的生长因子，对多种细胞增殖有刺激作用。EGF对毛囊的作用较为复杂，体内试验证明表皮生长因子受体(EGFR)分布于角朊细胞及毛囊上皮部分，EGF能抑Nd,鼠毛生长，注入羊体内可抑制羊毛生长并引起羊毛脱落。EGF对毛囊的促进作用，主要是促进毛囊上皮细胞的增殖，诱导毛囊提前由生长期进入退行期。利用免疫组化杂色和放射自显影研究显示成熟的毛囊外毛根鞘(ORS)内有EGF和大量的EGFR存在。EGF可能与外毛根鞘细胞上的受体结合后，引起外毛根鞘细胞的生长、合成与分泌活动的变化，从而使毛囊不能正常生长，导致退行期的改变，由EGF诱导毛囊退行期改变与体内改变是不完全相同。也有试验证明EGF可以诱导体外游离培养的人头皮毛囊或羊毛囊发生类似于本试验中羊毛的改变，使毛囊提前停止生长，进入退行期，而且使DNA的合成模式发生改变，对外根鞘细胞的DNA合成有明显的促进作用q。～。．“j。·”1．3．3碱性成纤维细胞生长因子碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)广泛参与毛囊形态发生的各个环节，尤其重要的是参与了毛囊发生的启动过程。在小鼠胚胎中，bFGF最先均匀地表达于真皮并在基板中显著上调；同样，在鸡胚皮肤中，碱性成纤维细胞生长因子受体(bFGFR)的表达方式与前者非常相似。鸡胚中，在与鸡毛基板发生有关的形10 山东农业大学博士学位论文态学改变出现前的二天，碱性成纤维细胞生长因子受体被检测到少量表达于即将出现基板处下方的致密真皮中，其后的一天，bFGFR就被检测到大量表达于致密真皮中，并且在即将形成基板中明显上调。如果在小鼠胚胎或鸡胚的真皮中持续表达稳定形式的bFGFR，将会导致异常的毛囊形成和毛囊再生。相反，bFGFR的无功能突变则会导致基板不能发育。同时，bFGF对于诱导“真皮细胞团”的形成也是必须的，实验证明当抑制bFGF表达或阻断与其受体结合时，真皮细胞团就停止发育。有实验证明提出：碱性成纤维细胞生长因子在小鼠的无功能突变会导致触须和全身2／3的毛囊不发育，而bFGF的过量表达则会导致口周的异常毛囊形成。其次，碱性成纤维细胞生长因子参与了毛干的分化过程：在毛干前体细胞进行终末期分化时，bFGF表达于毛球中部即将分化为毛干髓质的前体细胞中，而bFGFR则表达于毛干皮质和毛小皮的前体细胞以及外根鞘中。在转基因小鼠皮肤中过量表达bFGF会导致短毛畸形、毛干结构破坏和高硫蛋白在毛干中表达水平的增高，而在外根鞘过量表达bFGF则只会导致相似的短毛畸形。最后，bFGF可能参与了毛囊极性的调控。毛囊的生长是有极性的，他们前后不对称，并与皮肤呈一角度。如在鸡胚中过量表达bFGF和bFGFR，或在转基因小鼠的皮肤中过量表达bFGF和bFGFR都会导致毛囊极性的改变。1。3．4B．连环蛋白(13-catenin)及Wnt／[3．catenin信号通路13-catenin属于catenin蛋白家族，是一组具有相似结构的胞内糖蛋白家族，因其与E．钙粘素细胞内末端连接而被发现和命名。13-catenin具有广泛的生物学功能：如在上皮组织中，13-catenin与多种蛋白分子组成复合体参与胞膜粘着斑的形成。13-eatenin--端与跨膜蛋白E．钙粘素胞内末端耦联，构成E．cad／cat复合物，另一端锚定在细胞骨架上作为桥梁参与细胞间稳定的连接。IB-catenin的基因突变或结构异常会引起E．cad／cat复合体形成障碍。尽管其他粘附分子仍有表达，但却不能维持细胞与细胞间的正常连接，正常的细胞连接在组织发育过程中对于形态维持、空间分布以及细胞运动有着重要意义。lB-catenin还是writ信号通路的中心环节，许多信号分子的网络调控作用最终都汇集于13．catenin，在静息细胞中细胞内仅有少量游离的13．catenin，大部分结合在E．钙粘素上，其余部分结合在由APC、GSK．3p和axin共同组成的多蛋白复合体上。GSK-31B能使游离的p．catenin磷酸化而降解，使细胞内游离的p．catenin保持极低的水平。而当writ分泌性糖蛋白与膜上相应受体结合时，这一信号传递给dishevelled(dsh／dvl)蛋白，使其过度磷酸化。dsh／dvl的过度磷酸化进一步作用，使GSK．3p激酶灭活，结果p．catenin降解被阻滞细胞内的13-catenin水平升高。IB-catenin在细胞内的堆积使其可以通过核孔进入到细胞核中，作为 山羊毛囊细胞分离培养与鉴定及毛囊体外重塑研究转录激活因子激活相关转录过程。进入到细胞核中的B．cmemn与LEFffCF家族转录因子形成复合物参与转录激活，其作用的靶基因主要有C—myc、cyclinDl等。原癌基因C．myc启动子上有tcf-4的结合位点，13-catenin／tcf-4复合物即作用于此。最终激活C．myc基因转录活性，刺激细胞增殖(Jungeta1．，1998)。cyclinDl是另外一种靶基因，p．catenill／lefl复合物通过作用于cyclinDl启动子而激活其转录，最终引起细胞的不断增殖。13-catenin在毛囊发育与生长调控中同样有着重要意义，毛囊是皮肤重要的附属结构，是由动物胚胎期外胚层与中胚层相互诱导共同发育形成。发育初期，外胚层细胞向内凹陷与其下方迁移来的中胚层细胞相互作用形成毛芽原基，毛芽逐渐伸长并分化产生各种毛囊的细胞，最终形成完整的毛囊。毛囊发育过程中受到多种信号分子的调节，如wnt、bmp、shh、notch等，其中writ信号途径最为关键。相关研究表明在胚胎期及毛囊生长期，毛囊发育过程中p．catemnmRNA上调，当p．catenin发生基因突变时，胚胎毛囊的正常形成途径受阻，毛囊发生过程停滞；即使是毛囊形成后，如果p-catenin丧失活性，在生长期，毛纤维也将完全消失。可见，p-cmenin是毛纤维形成中不可缺少的调节分子，Huelsken等采用基因突变的方法进行研究发现13．catemn在毛囊形成中的重要作用还表现在以下几个方面：(1)p-cmenin有助于胚胎期基板的形成；(2)fl-catenin为毛囊干细胞的分化所必需。在B．catenin基因敲除小鼠中，由于D．cmemn与Tcf／Le馓活途径受阻，毛囊干细胞无法继续诱导形成毛囊，而阴性对照组的小鼠皮肤中稳定表达D．cmenin，出生后其毛囊和皮脂腺发育良好结构正常。Howe等研究发现在胚胎发育过程中，13-eatenin与核内Lef／Tcf结合能上调环氧合酶．2(cox．2)的转录活性。因此COX．2可能也是B．catenin／Lef-Tcf复合物转录的靶基因，p-cmenin有可能是通过启动COX．2基因表达来促进毛囊的发育和相关细胞的分化(Klooseta1．，2002)。1．4动物毛囊重建体外培养研究进展1．4．1毛囊体外诱导再生研究进展、上_磁体外诱导再生相关研究始于1994年，Limat等在I型胶原凝胶上单独接种ORSC或混合接种真皮成纤维细胞、毛乳头细胞和正常人皮肤角质形成细胞，先浸没培养3天，再进行气．液界面培养，均在胶原凝胶中诱导出表皮细胞团块样球形结构(Limateta1．，1996)。Hoffmann等在I型鼠尾胶原凝胶中接种人头皮成纤维细胞，经短暂培养后再混合接种预先分离的DPC(Hoffmanneta1．，1998)。再经过短期培养，接种ORSC细胞混悬液，或者接种DPC与ORSC混合细胞悬液，均诱导出少量毛囊样细胞团块。从上述 山东农业大学博士学位论文研究可知，设计动物类毛囊结构体外培养体系，必须尽可能地模拟活体生理状态，并且还应该具备以下条件：真皮细胞间充质支持系统一以提供毛囊上皮源性细胞与毛囊真皮源性细胞通过天然的细胞外基质(ECM)直接作用的三维空间环境；毛囊表皮细胞与毛囊真皮细胞通过基底膜样细胞层或ECM相互作用。从细胞形态学角度，三维空间环境可以模拟正常机体毛囊内、外根鞘与毛乳头那样结构和功能上均紧密相连的上表真皮组织部分，使体外培养的毛囊上皮细胞与真皮细胞相互诱导形成理想的同心圆状细胞聚合，并且体系中的上皮细胞经一段时期培养能够显示出旺盛的增殖、角化(如表达CK6、CKl4)能力。此外，气一液界面培养方法的应用更进一步模拟了大多数毛囊细胞在活体情况下的生长环境，使动物毛囊体外再生与重建成为可能。毛囊是一个复杂的皮肤衍生结构，虽然相关研究在体外诱导取得了一些进展，但准确的说还是毛囊样细胞结构，不是真正的毛囊，主要因为其不能在体外生长毛纤维，而且多数毛囊诱导重建模型依然要向体系中添加一定量的Matrigel。Matrigel是从EHS(Engelbreth-Holm—Swarm)小鼠肉瘤中抽提得到的可溶性基底膜提取物，是该肿瘤细胞分泌的特殊的细胞外基质，富含层粘连蛋白、IV型胶原、entaetin、硫酸肝素糖蛋白等细胞外基质蛋白和TGF．p、纤维母细胞生长因子、组织纤溶酶原激活物、金属蛋白酶和其他的一些生长因子。这些物质对毛囊细胞的粘附和分化有效应作用，但成分复杂，其中还含有少量对毛囊细胞迁移和分化有影响的刺激因子(Kimeta1．。2000；Rebrikoveta1．．2004)。因此目前现有的体外模型还未能诱导出具备完整生理功能的毛囊，也不适宜作为模拟胚胎期毛囊发育与分化和研究毛囊生长周期信号调控的通用体外生物模型。1．4．2毛囊真皮源性细胞对于体外毛囊诱导重塑的影响不同的研究模型发现的各种上皮细胞在毛囊形成中的被诱导能力有差异。Reynokls等发现大鼠毛母质生发上皮细胞分别与真皮鞘细胞和高代DPC组合，耳廓创口移植后均诱导产生了触须型毛囊和毛发，而与毛囊外根鞘细胞、皮肤基底细胞的组合没有成功诱导。说明毛母质生发上皮细胞具有胚胎细胞样特性，并可显著改变毛乳头细胞、真皮鞘细胞的行为一．魍、Inamatsu等的研究发现大鼠无毛区角质形成细胞可以延长大飘，DPC的传代次数，并维持其凝集性生长特性和诱导毛囊形成能力，说明毛囊外的上皮细胞也能改变毛囊真皮细胞的特性。众多的研究发现，毛乳头细胞能诱导无毛区皮肤产生毛囊，说明这些非毛囊上皮细胞也具有被诱导能力。培养的ORSC的被诱导能力被Gharzi等的研究证实。不同来源的真皮细胞存在形态、行为和生物合成上的差异。目前，所有研究的共识 山羊毛囊细胞分离培养与鉴定及毛囊体外重塑研究是毛囊间成纤维细胞和皮肤成纤维细胞没有诱导毛囊形成的能力。尽管DPC和DSC具有相同的胚胎来源，体外培养时均有较高的生物合成特性，在体时在结构和功能上可相互替代，但二者在解剖方面、一些生化反应方面及诱导能力上存在差异，如毛乳头细胞高表达碱性磷酸酶，而在真皮鞘细胞，只有球周真皮鞘细胞表达，而且有人认为只有球周真皮鞘细胞才具有诱导能力。一些作者认为，只有DPC具有内在的形成毛乳头样结构的生物钟特性，单独移植到皮肤后能形成不连续的毛乳头样结构而易于辨认，而DSC却不具备这样的生物钟。但实际的实验研究却发现，对人类来说，可能真皮鞘细胞的诱导能力更重要。将男性头皮源毛囊的球部真皮鞘移植到女性前臂，诱导产生了完整毛囊和大而黑的毛发，而移植乳头却诱导失败。其原因可能是移植后毛乳头从伤口脱落或被免疫排斥掉。在去掉人毛囊毛球部后，真皮鞘细胞可诱导上段毛囊再生新的完整毛囊和毛发(Gurskaya醪砝，1996)。这表明真皮鞘细胞在人毛囊重建中有着重要的诱导作用。毛囊的体外诱导多以失败告终。其原因在于，这些研究仅仅模拟了毛囊上皮和问质的接触作用环境，忽略了细胞因子、细胞外基质的协调参与在毛囊发育中的重要作用。研究发现，细胞外基质可以显著改变上皮细胞的分化方向。Fen'ads等用兔中心角膜(排除干细胞影响)与小鼠胚胎背部及足掌真皮构成重组体，诱导出正常小鼠表皮和毛囊皮脂腺单位。说明在胚胎真皮间质的影响下，不同的短暂增殖细胞群可重新获得一些干细胞特性，问质微环境不仅可改变上皮干细胞的命运，还可改变分化细胞的命运。PaR等用小鼠羊膜上皮与小鼠胚胎真皮组成复合体，诱导形成了完全的毛囊、皮脂腺和表皮，进上步证实了间质影响上皮分化(PaRetaL，1999)。1．43动物毛囊体外培养与毛囊细胞分离培养的研究进展毛囊是一个多层细胞组成的特殊器官，是一个具有周期性生长的皮肤附属器官。Hardy等1949年曾将未分化出毛囊的胚胎鼠皮肤种植到血浆凝块中进行悬滴培养，并培养出一种与机体内正常毛囊相似的毛囊结构。此后，Pllil州等，1990年建立了Memorams游离毛囊培养的模型，采用悬浮培养法在体外培养出完整的游离单个毛囊器官，并研究了一些有关细胞因子、皮质类固醇及药物对毛囊生长的影响(Phil刚et口f．，19鳟咒自50年代以来，国内一些专家对绵羊的体形、外貌、生产性能、裘皮品质、毛绒特性以及生长发育等方面做了大量研究，但对其皮肤及毛囊的培养方面研究甚少。1999年钟白玉等、2000年吕中法等少数研究者报道了有关重建毛囊的研究(钟白玉等，1999；吕中法等，2000)。毛囊是控制毛发周期生长的皮肤附属器，它是由上皮与真皮两大部分形成的，这两大部分问的相互协调对毛发的生长发育至关重要。多种生长因子、细胞因子、14 山东农业大学博士学位论文皮质激素、表皮与真皮间的相互作用等，均可对毛囊生长周期产生促进或抑制性影响。在取材后的毛囊组织内常可检测到多种生长因子及细胞因子的受体，并在毛囊培养实验中添加上述因子，来延缓毛囊的生长。但很多因子在毛发生长中的作用机理还有待于进一步研究，主要原因：(1)体外缺乏良好的培养模型。虽然发展到了有毛皮片培养、游离毛囊培养及毛囊器官型培养等技术，但获得真正具有分化潜能的毛乳头细胞与外根鞘细胞的分离和培养还是很困难的，因而实验研究难以精确到位。(2)缺乏针对毛囊的特异性分子。到目前除了已知的几种与毛囊外根鞘有关的中间丝相关蛋白外，其他许多分子在毛囊中的真正作用并不清楚。Stenn等对几十种与毛囊相关的分子(包括结构性分子、生长因子、细胞因子、皮质激素及药物性分子)的名称、存在部位及主要性能作了详细介绍(Stenneta1．，1994)。60年代的毛囊培养及重建，取自动物胚胎期皮肤或整片胚胎皮肤，然而这些皮肤维持毛发生长的能力随培养时间及胎龄的增加而减弱，到培养后期未再见有毛发生长，毛囊呈现退化及死亡迹象。1．4．4建立动物毛囊体外重塑培养模型的研究前景有些学者已经发现头发根部的毛囊中可能存在皮肤干细胞。干细胞是能发育成组织器官的“母细胞"，并确定位于表皮之下的毛囊侧部的一个凸起处栖息着毛囊干细胞，干细胞能够向下转移到毛囊根部，使毛发再生。这些皮肤干细胞还能够向上迁移，到达周围的皮肤。最先是在小鼠毛囊凸起处观察到皮肤干细胞上移现象。解剖表明，人类毛囊也有类似的凸起，并认为这一凸起是人类皮肤干细胞的源头。毛囊凸起中的干细胞是全能型的，既能发育成毛发，又能发育成皮肤细胞(Tsutomueta1．，1998；Tayloreta1．，2000)。研究毛囊的体外培养，将对进一步研究干细胞转化为毛囊奠定基础。研究山羊皮肤毛囊的体外培养成活率及生长情况，从生长到退化中的细胞变化，对于填补国内外有关空白，揭示羊绒毛生长退化机理；对进一步揭示自然情况下毛发脱落，抗癌药物引起毛发脱落机制等都具有重要理论价值。同时该研究还可能为进_步开发相关药物来治疗脱发或促进毛发脱落，人为调控绵羊绒毛生长与退化有关技术的开发、应用奠定基础。对动物育种也会产生积极影响。毛囊器官体外培养与重塑是探索毛囊生物学的良好实验模型，是世界尖端科技之一，是毛囊克隆技术研究涉及到的主要领域。世界相关研究机构利用毛囊克隆技术，动态观测生长因子、激素及药物对毛囊生长的影响，从而研制、开发出新一代促毛发再生 山羊毛囊细胞分离培养与鉴定及毛囊体外重塑研究系列药物。其实验原理是在模拟正常动物生理状态下，针对皮肤毛囊中的不同组织细胞，同时进行培养，以毛囊的增长长度作为药物筛选指标，确定各种毛纤维生长药物成分的比例，进行科学的比较研究。目前，利用于细胞进行组织重建和转基因研究成为生物医学领域的重要方向。毛囊干细胞研究不仅对了解皮肤组织器官发育、肿瘤疾病发生有重要意义，还将成为转基因和组织工程技术中重要的靶细胞(CuietaL，2012)。1．5本研究的目的与意义在山羊毛囊方面，尽管许多学者进行了大量研究，但关于毛囊细胞体外培养与体外毛囊重塑体系的建立等方面的报道较少。建立和完善体外培养山羊毛囊真皮与表皮细胞以及体外毛囊诱导重建的方法，对培养条件与相关理化环境进行探讨。可为进一步研究皮肤毛囊的生长发育规律奠定基础。同时也为进一步研究毛囊细胞生长、发育、分化、凋亡规律的研究建立离体的生物模型。对山羊毛囊细胞生长及毛纤维再生过程进行研究，探讨毛囊生长调节机制以及羊的绒毛生长退化机理，最终将为毛囊真皮与表皮细胞互作机制、毛发再生与毛囊重建等研究以及羊绒产量和品质的提高等，开拓新的研究途径，增加新的研究内容和研究手段。2材料和方法2．1实验材料2．1．1实验动物种群的维持与样品采集本实验所需实验动物为济宁青山羊，来自山东省济宁市嘉祥县梁山县等地羊场。购买的青山羊均饲养在山东农业大学动物科技学院实验站的羊场内，精心饲养管理，自然交配。对初生的羔羊进行系谱记录和形态拍照，并描述其毛色花纹等。选取经自然交配产出的l～3日龄青山羊羔羊，运用外科手术的方法，随机活体采集羔羊颈背部约150ram2(15mmxlomm)的皮肤组织样。先用碘酒和酒精消毒，再用含高浓度抗生素的D．Hank’s液洗净酒精后，放入无血清DMEM／F12培养液中，置于冰袋中带回实验室。为保证皮肤毛囊相关细胞体外培养的成活率，取下的皮肤组织样品需在12h内进行分离培养。2．1．2主要仪器设备C02培养箱(LRH．250)、体视显微镜(Chinde．C127)、倒置荧光显微镜 山东农业大学博士学位论文(Nikon．FV300)、倒置相差显微镜(Chinde．C30b)、普通显微镜(Nikon．LVlOOD)、显微拍摄系统(Chinde-200D)、Real-Time荧光定量PCR仪(MX3000P，Stratagene公司)、三重纯水蒸馏器(PL5243，ELGA)、自动高压灭菌锅(MLS3020，SANYO)、离心机(Hitachi．CI毪1E)、电子天平(XB220A，Precisa)、超净工作台(SW-CJ．1C，苏州净化设备厂)、梯度PCR仪(5331，德国Eppendorf公司)、稳压电泳仪(DYY-12，北京六一仪器厂)、凝胶成像系统(JY04S．3A，君意东方)、石蜡切片机(2235，Leica)、真空干燥箱、磁力搅拌器(78．1，常州国华仪器厂)、酸度计、超声波清洗机。2．1．3主要试剂及其来源DMEM／F12培养基(粉末)、MEM培养基(粉末)、DMEM高糖培养基(粉末)、无血清角质细胞培养液(K．SFM，Ix)、中性蛋白酶、胶原酶D均购自Gibco公司；硫酸软骨素A、I型鼠尾胶原原液、胰蛋白酶、类胰岛素生长因子(IGF．I)、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)均购自Sigma公司：透明质酸钠、100x青／链霉素浓缩液、TritonX．100原液购自Solarbio公司；总RNA提取试剂盒TRIZOLReagent、SuperscriptIII逆转录酶、Lipofectmine刚2000脂质体转染试剂盒购自Invitrogen公司；1xPBS平衡盐溶液、秋水仙素购自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)购自MDgenics公司；氢化可的松(Hydrocortisone)购自Peprotech公司：抗cytokeratin．19单抗购自Acris公司；抗仅．SMA单抗、抗Vimentin单抗购自Abeam公司；RNase-FreeDNaseI(DNaseI)购自Promega公司；RNA酶抑制剂(RNasin)购自TaKaRa公司；SYBRGreenQPCRMasterMix荧光定量试剂盒购自Stratagene公司；Giemsa染液原液购自Fluka公司；．谟它生化常规试剂均为国产分析纯。_÷一12．1．4培养液和常用试剂的配置(1)100xTylosin贮存液：称取0．259Tylosin溶于50mL的PBS平衡盐溶液中，过滤除菌，-20℃封存，分装备用。(2)IGF-I贮存液：将101xgIGF-I粉末溶解于3001aL三蒸水中，全部移出，并用3000L三蒸水润洗原包装管两次，均全部移出，定容至lmL，．分装备用。 山羊毛囊细胞分离培养与鉴定及毛囊体外重塑研究(3)EGF贮存液：将100I_tgEGF粉末溶解于300rtL三蒸水中，全部移出，并用3001xL三蒸水润洗原包装管两次，均全部移出，定容至lmL，分装备用。(4)bFGF贮存液：将21xgbFGF粉末溶解于3009L三蒸水中，全部移出，并用3001xL三蒸水润洗原包装管两次，均全部移出，定容至lmL，分装备用。(5)DMEM／F12培养液：称取DMEM／F12粉末15．69，NaHC031：29，100x青／链霉素浓缩液10mL，100×Tylosin贮存液10mL，用水定容至1000mL。(6)MEM培养液：称取MEM粉末9．59，NaHC032．29，100x青／链霉素浓缩液10mL，100xTylosin贮存液10mL，用水定容至1000mL。(7)DMEM高糖培养液：称取DMEM粉末13．59，NaI-IC032．29，100×青磁霉素浓缩液10mL，100×Tylosin贮存液10mL，用水定容至1000mL。(8)0．25％胰酶消化液：0．259胰酶溶于100mL无血清培养液中，完全溶解后，过滤除菌，分装4。C保存，存储期不多于30d为佳。(9)o．25％ee性蛋白酶消化液：0．259Dispase溶于100mL无血清DMEM／F12培养液中，充分溶解混匀后，过滤除菌，并于使用前配制。(10)2mg／mL胶原酶D消化液：准确称量O．29胶原酶D溶解于100mL无血清DMEM／F12培养液中，充分溶解混匀后，过滤除菌，使用前配制。(11)鼠尾胶原储存液的配制：(包被浓度为5rtg／mL)在无菌条件下，用6mol／mLHAc将I型鼠尾胶原原液(Smg／mL)稀释成500pg／mL的储存液，一20"C封装备用。(12)100x硫酸软骨素A储存液的配制(包被浓度为20rtg／mL)．在无菌条件下，取200mg硫酸软骨素A溶于100mL无血清DMEM／F12培养液中，待充分溶解后，过滤分装，·20。C保存备用。(13)100x透明质酸储存液的配制(包被浓度为100}tg／mL)．．在无菌条件下，取19透明质酸钠粉末溶于100mL无血清DMEM／F12培养液中，待充分溶解后，过滤分装，一20。C保存备用。(14)1％TritonX．100溶液：无菌条件下精确吸取1mLTritonX．100原液，加入到90mL无菌三蒸水中，充分混合均匀，分装放入46C冰箱保存备用。(15)秋水仙素溶液：称取10mg秋水仙素，溶解于100mLPBS平衡盐溶液中(即为100I．tg／mL)，过滤除菌，．20。C保存。(16)Carnoy’s固定液：将甲醇与冰醋酸按体积比3：l的比例充分混合，使用前配制并于冰上保存。 山东农业大学博士学位论文(17)Giemsa染色应用液：利用无菌三蒸水按照1：10的体积比例稀释Giemsa染液原液，充分混合，即为Giemsa染色应用液，使用前配制。2．2试验方法2．2．1外根鞘细胞原代培养用细胞培养板的处理将预先采集1～3日龄青山羊(其它山羊品种亦可，但以外根鞘细胞的供体山羊品种为最佳)背部约0．5cmx0．5cm的皮肤组织在无菌超净台内剪成lmm3的组织碎块，用无菌弯头镊将组织碎块均匀接种于6孔细胞培养板中，先加入每孔lmL含10％FBS的DMEM培养液，37℃，5％c02浓度的饱和湿度条件下进行培养。4h后补加含10％FBS的DMEM培养液至每孔3mL，放回继续培养，经3～5天细胞生长至汇合时，除去皮肤组织碎块和培养液。加入每孔3ml的无菌1％TritonX．100于单层细胞上，37"C孵育30rain后，去除TritonX．100溶液，用无菌超纯水冲洗干净，置于4"C下备用。2．2．2毛乳头细胞原代培养用细胞培养板的前期处理在无菌冰浴条件下，准确量取I型鼠尾胶原储存液、透明质酸钠贮存液、硫酸软骨素A贮存液各150弘L，依次溶入15mL无血清DMEM／F12培养液中。前一种试剂需充分混匀后再加入下一种试剂。调节pH值至7．2~7．4后，分别加入2组6孔板的板孔中，每孔约lmL。37℃孵育，待凝胶凝固，经臭氧灭菌消毒，密封放入4。C冰箱储存并在短期内应用于毛乳头细胞原代接种。2．2．3济宁青山羊次级毛囊的分离将活体采集的皮肤组织样品经70％酒精浸泡，PBS液冲洗后，剪除裸露于皮肤表面的毛干，无菌生理盐水冲洗直至表面清洁无污物后，立即用添加青霉素(400U／mL)、链霉素(400ttg／mL)和Tylosin(250ttg／mL)的lxPBS液浸洗5次。将皮肤表面的杂物充分清理干净，随即置于体式显微镜下，用解剖针在培养皿中尽量刮去残余裸露毛干及皮下脂肪，无菌生理盐水冲洗去表面污物，碘酒擦拭及75％7,醇脱碘，浸入含高浓度抗生素的PBS平衡盐溶液中带入无菌间进行下一步的操作。‘·‘进入无菌间后，将前期进行处理的皮肤组织块，浸入约20mL的无菌0．25％中性蛋白酶(dispase)中，4"C消化处理5h，然后放入新的PBS液中，手术刀在真皮与皮下组织之间切开，再用无菌弯头镊揭去表皮层后，在体式显微镜下用灭菌镊子夹住次级毛囊远端，顺毛囊方向拔出毛囊，置于培养液中，如此快速分离青山羊次级毛囊，并于6h之内进行毛囊相关细胞的分离培养实验。剩余的皮肤放入相应培养液，然后置于4。C冰19 山羊毛囊细胞分离培养与鉴定及毛囊体外重塑研究箱中待用，但不能超过24h。2．2．4青山羊毛囊外根鞘细胞体外培养体系的完善2．2．4．10RSC分离培养用培养液配方完全培养液：含EGF、IGF．I、氢化可的松和10％FBS的DMEM／F12培养液；工作培养液：含IGF．I、EGF、氢化可的松的无血清角质细胞培养液；维持培养液：含IGF．I、EGF、氢化可的松和2％FBS的DMEM／F12培养液。2．2．4．2青山羊毛囊外根鞘细胞的原代培养将分离得到的次级毛囊经无菌PBS浸洗后，均匀贴附于预先铺有青山羊真皮成纤维细胞ECM的6孔培养板中，逐滴缓慢加入0．25％胰蛋白酶至刚刚浸没游离次级毛囊，37℃孵育10min。利用微量移液器吸出板孔中残留的消化酶，随即加入少量完全培养液(约lmL)，37。C孵育1h以促进毛囊贴壁。待多数次级毛囊贴附牢固后，补加完全培养液至每孔3mL，37。C、5％C02饱和湿度环境下进行培养，每天观察并记录毛囊细胞分离生长情况。待毛囊周围迁移出大量上皮样细胞后，更换为每孔3mL工作培养液，放入37℃，5％C02饱和湿度培养箱中启动ORSC原代培养。倒置显微镜下观察，游离出的毛囊外根鞘细胞(ORSC)生长成单层后，消化移入培养瓶中使用工作培养液继续进行培养，2～3天更换一次工作培养液培养液。2．2．4．3毛囊外根鞘细胞的传代培养与纯化当原代细胞生长至完全汇合时，进行传代。首先弃旧培养液，PBS液冲洗细胞1次，加入约lmL浓度为0．25％的胰蛋白酶浸润细胞数秒。弃去后，再加入5mL胰蛋白酶消化处理约10min。当观察到有细胞贴附的瓶壁逐渐变白，且轻轻晃动有微小细胞团块脱落，便可加入10％FBS的DMEM高糖培养液终止消化，吸管吹打成细胞悬液，1000r／min下离,t),5min后收集细胞，分瓶后加入工作培养液放回培养箱中继续培养，每3天换一次工作培养液。经过多次传代培养，显微镜下观察可见培养细胞中成纤维形态细胞逐渐减少，上皮样细胞形成明显优势细胞群。待细胞纯链完成，即将工作培养液换成维持培养液，以利于ORSC在体外的长期传代培养。采用此分离培养方法，ORSC细胞已传至40代，其生长增殖活力旺盛。挑选可稳定遗传的对数期毛囊外根鞘细胞进行细胞形态学观察并绘制生长曲线。2．2．4．4毛囊外根鞘细胞的Giemsa染色将灭菌盖玻片放入一次性细胞培养皿中，按照细胞传代方法制备外根鞘细胞悬液，20 山东农业大学博士学位论文取2taLON入35mm细胞培养皿中，置于37。C、5％C02培养箱中培养。待ORSC在盖玻片上长成良好单层后，取出玻片并浸入无水甲醇中固定15min，再用新的无水甲醇冲洗细胞一次，随即放入Giemsa染色应用液中染色5～10min。从Giemsa染色液中取出玻片，去离子水冲洗净残余染色液，经过于燥和二甲苯透明。最后，中性树脂封片，显微镜下观察、拍照。2．2．4．5细胞生长曲线的测定收获生长状态良好的对数期ORSC，采用细胞传代的方法制成细胞悬液。经计数后，将密度为1．02x104个／mL的细胞悬液接种于24孔细胞培养板中，每孔lmL。每隔24h取出3个孔的细胞分别进行计数，取平均值。以培养时间为横轴，每天的细胞数平均值为纵轴，作图，即得体外培养毛囊外根鞘细胞的生长曲线。2．2．4．6青山羊毛囊外根鞘细胞的染色体核型分析待传代培养的ORSC生长至对数生长期时，将细胞移入25mL培养瓶中，C02培养箱中培养54h。将0．5pg／mL秋水仙素加入维持培养液中，继续培养约8h。消化收集细胞，逐滴加入0．5mL预温37℃的低渗液(即O．075mol／L的KCl溶液)并混匀，随即补加低渗液至5～10mL，用吸管轻轻吹打均匀，37。C孵育30min。低渗处理后向管中加入lmL新鲜Camoy’S固定液进行预固定，离心去上清后加入10mL新鲜Camoy’s液进行固定及再固定。最后，收集细胞进行Giemsa染色，中性树脂封片，镜检。2．2．4．7青山羊毛囊外根鞘细胞的免疫细胞化学鉴定取1．5mLORSC悬液均匀接种于清洁无菌的盖玻片上，置于37"C，5％C02浓度培养箱中培养。待ORSC长至盖玻片80％以上面积时，取出盖玻片经PBS清洗后，用．20℃醋酸乙醇固定液固定20min，PBS清洗3次(每次3min)。按照即用型BiotinSP．HRP免疫组化试剂盒说明步骤进行细胞角蛋白．19(CK-19)免疫细胞化学检测，最后用DAB底物于暗处显色3～10min，蒸馏水清洗后，观察，照相。2．2．4．8毛囊外根鞘细胞的形态回复实验利用细胞传代的方法，接种两组生长于维持培养液中的ORSC，当细胞生长成良好的单层后，将组A更换为10mL工作培养液，组B仍保持10mL维持培养液，均置于37℃，5％C02浓度的条件下进行培养，每3天更换1次培养液，显微镜下每天观察ORSC的生长情况和形态变化。2．2．5济宁青山羊毛乳头细胞的体外分离与培养2．2．5．1DPC分离培养用培养液配方 山羊毛囊细胞分离培养与鉴定及毛囊体外重塑研究完全培养液：含EGF、bFGF和10％FBS的DMEM／F12培养液；维持培养液：含EGF、bFGF和2％FBS的MEM与DMEM／F12(1：1)混合培养液。2．2．5．2青山羊毛乳头细胞的分离与原代培养选取活体采集的含完整皮肤全层与皮下组织层的青山羊皮肤组织样，超净台上经70％酒精浸泡数秒，PBS液冲洗后，剪除皮肤表面毛干及边缘不规则组织。随后将皮肤样品剪成约0．3cmx0．5em大小的条状组织块，并均匀铺展于无菌一次性细胞培养皿中，逐滴加入0．25％中性蛋白酶至完全浸没组织样块，37*(2孵育约2h，移除残余蛋白酶液。置于体视显微镜下使用神经外科镊缓慢揭去表皮，此时多数毛囊上半部随表皮一并拔出。换用眼科剪沿真皮与皮下组织交界处剪开，移除真皮层，随后使用弯缘眼科镊轻轻挤压皮下脂肪组织表面，以显露毛囊下半部与毛球部，随即逐一拔出具完整毛球部的毛囊下段，并且经无菌PBS浸洗后，均匀贴附于预先铺有I型鼠尾胶原、透明质酸及硫酸软骨素A的6孔细胞培养板中。缓慢逐滴加入2m咖L的胶原酶D消化液，每孔约lmL，37。C孵育2h。利用微量移液器吸出板孔中残留的胶原酶，随即加入少量完全培养液(约lmL)浸洗2次，再添加完全培养液每孑L3mL，37。C、5％C02饱和湿度环境下启动毛乳头细胞原代培养，每天观察并记录毛乳头细胞分离生长情况。待毛囊周围迁移出的细胞(DPC)生长成单层后，消化移,入25cm2培养瓶中使用完全培养液继续进行培养，每3天更换一次完全培养液。2．2．5．3毛乳头细胞的传代培养、纯化与生物学特性保持当原代毛乳头细胞生长至完全汇合时，进行传代。其方法与ORSC传代方法类似，即除去旧培养液，加入少量胰蛋白酶消化液浸润细胞数秒。弃去后，再加入5mL0．25％胰蛋白酶，室温消化处理约10min。当观察到有细胞贴附的瓶壁逐渐变白，且轻轻晃动有微小细胞团块脱落，便可加入10％FBS的DMEM高糖培养液终止消化，低速离心收集细胞，分瓶后加入维持培养液放回培养箱中继续培养，每3天换一次维持培养液。利用毛乳头细胞对不同消化酶的敏感度差异性以及具有差速贴壁性对其进行纯化。当毛乳头细胞生长至良好单层时，弃掉旧培养液产无菌PBS液浸洗细胞一次。先加入4mL浓度为0．25％胰蛋白酶，室温消化约3min，吸去残余消化液，随即加入5mL含10％FBS的DMEM高糖培养液，使用无菌巴氏吸管轻轻吹打有细胞贴附的瓶壁。弃去细胞悬液，再加入4mL2mg／mL的胶原酶D消化液处理细胞20min，弃去消化液并加入含10％FBS的DMEM高糖培养液吹打成细胞悬液。将毛乳头细胞混悬液接种于新培养瓶中，37*(2孵育约2h，取出轻轻震荡培养瓶将未贴壁的细胞弃去，已贴壁的细胞即为纯一的青山羊毛乳 山东农业大学博士学位论文头细胞。随后每瓶加入10mL维持培养液，37。C、5％c02饱和湿度环境下继续对毛乳头细胞进行培养。挑选可稳定遗传的对数期毛乳头细胞进行细胞形态学观察并绘制生长曲线。2．2．5．4毛乳头细胞的形态学观察实验将灭菌盖玻片放入一次性细胞培养皿中，取2mL毛乳头细胞悬液加入培养皿中，置于C02培养箱中培养。待DPC在盖玻片上长成良好单层后，取出玻片并浸入无水甲醇中固定15rain，再用新的无水甲醇冲洗细胞，随即放入Giemsa染液原液中染色5～10min。从Giemsa染液中取出玻片经过干燥和二甲苯透明。最后，中性树脂封片，显微镜下观察、拍照。2．2．5．5细胞克隆形成率的测定将传代毛乳头细胞按照不同密度(10个／mL、20个／mL、40+／mE、80个／mL)接种于35mm培养皿内，每细胞密度设置三个重复，培养5天后在40倍放大倍数的倒置显微镜下观察记录各培养皿内的细胞克隆数，取均值得出每个细胞密度平皿中的细胞克隆数，定义大于50个细胞的细胞团为一个克隆，计算克隆形成率。细胞克隆形成率=平均克隆数／(细胞密度x接种细胞混悬液体积)x100％2．2．5．6毛乳头细胞的染色体核型分析待传代培养的DPC生长至对数生长期时。将0．08“g／mL秋水仙素加入维持培养液中，继续培养约2h。消化收集细胞，逐滴加入0．5mL预温37"C的低渗液(即0．075mo儿的KCl溶液)并混匀，随即补加低渗液至5～10mL，用吸管轻轻吹打均匀，37℃孵育30min。低渗处理后向管中Nh]mL新鲜Carnoy’s固定液进行预固定，离心去上清后加入10mL新鲜Camoy’S液进行固定及再固定。最后，收集细胞进行Giemsa染色，中性树脂封片，镜检。2．2．5．7青山羊毛乳头细胞的免疫荧光染色鉴定取1．5mLDPC悬液均匀接种于清洁无菌的盖玻片上，置于37"C，5％C02浓度培养箱中培养24h。待DPC长至盖玻片80％以上面积时，取出盖玻片经4"C预冷无菌PBS液清洗后，用-20℃醋酸乙醇固定液固定20min，4。C无菌PBS清洗3次(每次3rain)。向贴附细胞一侧的盖玻片滴力fll：100抗d．SMA和1：200抗波形蛋白(Vimentin)的单克隆抗体，置于4"C孵育过夜，然后滴加山羊抗兔IgG荧光素(FITC)标记二抗，室温孵育2h。以青山羊真皮成纤维细胞及外根鞘细胞作为阴性对照，同时置于倒置荧光显微镜下观察，照相。2．2．6青山羊真皮成纤维细胞的分离培养及其细胞系的建立2．2．6．1DFB分离培养用培养液配方 山羊毛囊细胞分离培养与鉴定及毛囊体外重塑研究完全培养液：含bFGF和10％FBS的DMEM／F12培养液；维持培养液：含bFGF和5％FBS的DMEM高糖培养液。2．2．6．2青山羊真皮成纤维细胞的原代培养将采集的皮肤组织样经70％酒精浸泡，剪除表面毛发后，PBS液冲洗干净，吸去PBS液，加入约10mL0．25％中性蛋白酶，4"C消化过夜。体式镜下，用无菌弯头镊分离皮肤表皮层与真皮层，用无菌眼科剪将真皮组织剪成约lmm3的小块，浸入0．25％胰蛋白酶中消化30min，随后将其均匀贴附于6孔培养板中，放在37℃，5％C02浓度的饱和湿度条件下，4h贴附牢固后按照每孔3mL加入完全培养液，放回培养箱中进行培养。待外植块迁移出大量细胞后，更换为相同体积的维持培养液，在37。C，5％C02浓度的饱和湿度培养箱中继续培养。待游离出的真皮成纤维细胞(DFB)生长成单层后，消化移入培养瓶中进行培养，按照每瓶10mL量加入完全培养液进行培养，3天后更换为等量维持培养液，此后2~3天更换维持培养液一次。2．2．6．3青山羊真皮成纤维细胞的传代培养当真皮成纤维细胞(DFB)生长至汇合状态后，进行传代。首先弃掉旧维持培养液，PBS液冲洗细胞1次，加入约lmL浓度为0．25％的胰蛋白酶浸润细胞约5秒。弃去胰蛋白酶，再加入4mL浓度为0．25％的胰蛋白酶，常温下消化处理约5min。当观察到有细胞贴附的瓶壁逐渐变白，且轻轻晃动有微小细胞团块脱落时，便可加入6mL完全培养液洗净残余消化液，1000r／min下离心5min后收集细胞，分瓶后按每瓶10mL量加入完全培养液放回培养箱中继续培养，3天后更换为等量维持培养液，此后每3天更换维持培养液1次。利用该原代培养与传代培养技术，青山羊DFB已稳定传至第56代，其生长分裂状态依然良好。挑选可稳定遗传的对数期真皮成纤维细胞进行形态学观察并测定生长曲线。2．2．6．4青山羊真皮成纤维细胞的生物学特性检测将灭菌盖玻片放入一次性细胞培养皿中，取2mL真皮成纤维细胞悬液加入培养皿中，置于C02培养箱中培养。·’待DFB在盖玻片上长成良好单层后，取出玻片进行Giemsa染色，经过干燥和二甲苯透明。最后，中性树脂封片，显微镜下观察、拍照。收获生长状态良好的对数期DFB，采用细胞传代的方法制成细胞悬液。经计数后，将密度为每mL约含2．0x104个细胞的细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，每天接种4孔，每孔0．1mL，放于37"C，5％C02环境下培养，至第8天。将新鲜配制的MTT溶液加入含有细胞的培养板孔中，每孔10此，继续置于C02培养箱中培养4h，取出。每孔再加入lOO皿24 山东农业大学博士学位论文Formanzan溶解液，置于37"C环境下孵育约4h，直至在倒置显微镜下观察发现生成紫色结晶(Formanzan)全部溶解，最后在570nm波长下，利用酶联免疫检测仪测定每组细胞光吸收值，记录结果，求取平均值。以培养时间为横轴，每组细胞光吸收值平均值为纵轴，作图，即得到体外培养真皮成纤维细胞的生长曲线。待传代培养第56代的DFB生长至对数生长期时，将细胞移A．25cm2培养瓶中，C02培养箱中培养48h。将0．08p．g／mL秋水仙素加入维持培养液中，继续培养约2h。消化收集细胞，逐滴加入0．5mL37℃的低渗液(即O．075mol／L的KCI溶液)并混匀，随即补加低渗液至5～lOmL，用吸管轻轻吹打均匀，37"C孵育30min。低渗处理后向管中加入lmL新鲜Camoy’s固定液进行预固定，离心去上清后加入lOmL新鲜Camoy’S液进行固定及再固定。最后，收集细胞进行Giemsa染色，中性树脂封片，镜检。2．2．6．5微生物污染检测将待检DFB接种于无抗生素的完全培养液中，置于37。C，5％C02浓度的饱和湿度培养箱中培养3d，与存在细菌污染及真菌污染的细胞进行比对，判断其是否存在细菌及真菌污染。将传至56代的DFB培养于无抗生素的完全培养液中，一周内不更换培养液。随后用无菌细胞刮收集待检细胞，沸水浴10min，12000r／min下离一t],5min后，吸取上清液作为PCR反应模板，DNA阳性对照和阴性对照共同放入PCR仪进行PCR反应扩增。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色观察，照相。2．2．6．6真皮成纤维细胞的冻存与复苏选择对数生长期细胞，利用传代培养的方法制成细胞悬液，然后加入冻存培养液(含10％DMSO和30％FBS的DMEM／F12培养液)，以每毫升5x106个真皮成纤维细胞的细胞密度，分装入1．8mL无菌冻存管中，封口，标记。将冻存管依次置于4"Clh、．20℃lh、．70。C12h，最后移入液氮中长期保存细胞。复苏细胞时，用40"C温水快速解冻细胞，然后逐滴加入10mL完全培养液缓慢稀释冻存液，混匀后低速离心，去上清。再用完全培养液适当稀释后，按5x105+／mE的细胞’密度接种于培养瓶。2．2．6．7脂质体介导转染青山羊真皮成纤维细胞收获传至56代生长良好的DFB，1x106个／mL的细胞密度接种于6孔板中，在37"C，5％C02浓度的饱和湿度条件下培养至对数生长期，更换为无血清无蛋I圭tOPTI—MEM培养液，采用Lipofectamine2000介导方法分别转染pEGFP-N3，AcGFPl，pECFP-N1和 山羊毛囊细胞分离培养与鉴定及毛囊体外重塑研究pDsRedl．N1，6h后将OPTI．MEM培养液更换为完全培养液继续培养，在荧光倒置显微镜下观察转染24h、48h和72h的DFB生长及荧光表达情况，并测定转染率。2．2．7青山羊毛囊体外重塑模型的建立2．2．7．1毛囊间充质细胞胶原凝胶的制备在无菌冰浴条件下，按比例分别将鼠尾胶原、透明质酸、硫酸软骨素A依次加入到MEM与DMEM／F12(1：1)混合培养液中，制成凝胶。调节pH至7．2～7．4，将凝胶溶液加入24孑1,板中，每孔1．0mL。将前期分离培养的毛乳头、真皮成纤维细胞用含EGF、bFGF和5％FBS的MEM与DMEM／F12(1：1)混合培养液制成细胞混悬液，用无菌吸管将细胞混悬液加入24孔板中，待其在常温下形成凝胶后，置于37。C、5％C02的饱和湿度环境中进行培养。每天在显微镜下观察DPC与DFB的生长增殖情况。待毛囊真皮细胞达到完全汇合后，表面覆盖预先制备的ORSC细胞混悬液，继续培养3～5天，观察ORSC于毛囊真皮细胞胶原凝胶上形成完整单层后，去除IEt的培养液，加入少量(恰好覆盖表面ORSC细胞即可)含IGF．I、EGF的无血清角质细胞培养液，在37。C、5％C02的饱和湿度环境中进行气．液界面培养，每两天更换一次表层培养基，并注意随时显微观察拍摄，记录体外重塑毛囊的分化过程与形态变化。2．2．7．2青山羊体外重塑毛囊的形态学观察分别在进行气．液界面培养后的第7天、第14天、第21天用无菌细胞刮刮取凝胶表层以获取体外重塑的毛囊结构，放入Bouin氏固定液中固定24h，随后用超纯水浸泡约2h软化样品，按梯度逐级转入酒精溶液中脱水处理，二甲苯透明两次浸蜡包埋。分别按照横切与纵切进行切片，切片厚度为5pm，切片贴附牢固后，苏木素．伊红(H．E．)染色，最后再经乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，置于光学显微镜下观察拍照并与体内皮肤毛囊石蜡切片进行组织形态学比较。2．2．7．3体外重塑毛囊与体内分离毛囊毛纤维生长速度的比较选取前期分离的具有正常结构的次级毛囊60根，平均分为3组，每组20根。均放置在24：fl。塑料培养板内，每孔含0．8mL含EGF、bFGF和5％FBS的MEM与DMEM／F12(1．1)混合培养液，每孔1根；选取体外成功重建的毛囊组织60根(体外气．液界面培养21天)，平均分为3组，每组20根。与体内分离的次级毛囊同时培养于37。C、5％C02的饱和湿度环境中。在倒置显微镜下，利用目镜测微尺每天测量毛囊的长度，观察毛囊的形态变化。统计分析毛囊的生长速度和最终的生长长度，利用SAS9．0统计分析软件，以毛囊每天的测量长度作为变量，统计分析不同培养基对毛囊生长速度的影响。 山东农业大学博士学位论文2．2．7．4体外重塑毛囊中关键基因表达量的测定采用实时荧光定量RT．PCR方法检测体外重塑毛囊中关键基因KRT6、KRTl4、EGF和135-catenin基因mRNA的表达，以持家基因GAPGH为内参，引物序列见表2．1。分别收集体外培养第14天与第21天的重塑毛囊，提取RNA，每一代细胞3个重复，提取3日龄济宁青山羊羔羊皮肤毛囊中RNA。在StratageneMx3000P荧光定量PCR仪上进行PCR反应，PCR反应体系为20pL：SYBRPremixExTaqTM10此，ROXReferenceDye0．4}LL，上游引物(10lmaol／L)0．3pL，下游引物(101unol／L)0．3肛L，cDNA模板2此，补灭菌双蒸水至20此。荧光定量PCR反应参数为：第一阶段预变性95℃60s，第二阶段95℃5s，58℃30s，72℃15s，共40个循环。表2．1荧光定量PCR所用引物序列与退火温度Table2-1PrimersequencesandannealingtempinFO．PCR基因引物序列(5’．3’)产物大小墅曼塑9竺婴堡眨曼：2塑鲤堕i塑旦!!塑尘KRT6-F5’．TCAGACACATCCGTGGTGCTATC-3’⋯．KRT6-R5，．GATAGCACCACGGATGTGTCTG．3，156bpKRTl4-F5’-GGAACAAGATTCTCACAGCCACAG-3’⋯．KRTl4-R5，．CACTGTGGCrGTGAGAATCTrGTr．3，lfj5bpEGF-F5’-TCCTGTCCGTGTATCGGAA-3’⋯EGF-R5’．AGCCACTAAGTTGGCAATGC-3，1z7Dp艮-catenin-F5’．AACACAGCAGCAGTTTGTGG．3’⋯li：eatenin．R5，．CTGCACAAACAATGGAATGG．3，139bpGAPD宝F5ZGGTGATGCTGGTGCTGA嚣’259bpGAPDHRTCCCTCCACGATGCCAAA．5’．．3，+退火温度均为58℃。+Annealingtempwas58"C．2．2．7．5实验数据的统计分析基因表达丰度采用目的基因与内标基因的(1+E)也△Q表示，其中E为扩增效率，当目的基因和持家基因扩增效率接近100％时用2-zxzxct表示。实验数据用SPSSl3．0软件进行差异显著性分析。3结果与分析3．1青山羊毛囊外根鞘细胞培养体系的优化3．1．1毛囊贴壁法培养外根鞘细胞的生长状态与形态学观察利用贴壁法分离毛囊外根鞘细胞，在完全培养液中，4~5天便可见毛囊外根鞘边缘向外游离生长出单个细胞(图3．1a)，培养一周左右即可明显看到大量细胞从外根鞘边缘生长出来，其中混杂有上皮样形态细胞(细胞呈圆形，随后伸展成多角形，似鹅卵石状) 山羊毛囊细胞分离培养与鉴定及毛囊体外重塑研究和成纤维形态细胞(形状不规则，常成短梭状平行排列)(图3．1b)。随着游离生长细胞的增多，生长速率逐渐加快，在第15天左右时，细胞进入对数生长期。此时完全培养液更换为工作培养液，上皮样形态细胞(ORSC)依然保持快速的生长速率和旺盛的增殖活性，而成纤维形态细胞生长受到明显抑制，随着传代培养的进行，上皮样形态细胞(ORSC)形成优势细胞群，在倒置相差显微镜下观察，可见毛囊外根鞘细胞排列紧密规则，细胞饱满，透明度高，胞核圆形，胞质较少(图3．1c)。当细胞传至5代以上时，其增殖活性开始降低，个别细胞出现空泡化、凋亡等现象，此时将工作培养液更换为维持培养液，ORSC逐渐恢复良好的生长与增殖活力，随后多数细胞向四周呈克隆状生长，胞体延长，向外伸出2~4个片足，形成致密单层后细胞由上皮样形态变化为短梭状平行排列(图3．1d)。图3．1体外培养的青山羊毛囊外根鞘细胞(×100)Fig．3-lOuterrootsheathcellsofgreygoatinculture(×100)3．1．2山羊毛囊外根鞘细胞Giemsa染色的观察结果体外培养的毛囊外根鞘细胞经Giemsa染色后，可见细胞质呈淡蓝色，胞体近中央处有椭圆形的细胞核，呈深蓝色，其中可见1～2个核仁(图3．2a)。观察处于对数生长期的ORSC，视野中可见较多量的有丝分裂相细胞，采用该染色法可较清晰的显示出细胞分裂的不同时相(图3．2b)。当培养瓶内的细胞形成良好单层后，经染色可见只有极少量细胞处于分裂周期(M期)，大部分细胞出现接触抑制(图3．2c)。其中，个别细胞出现胞核分裂，胞质未分裂的现象，形成合胞体状(图3．2d)。、。。l砻彰20≮．j“ 山东农业大学博士学位论文图3．2体外培养的青山羊毛囊外根鞘细胞Giemsa染色(×200)Fig．3-2Giemsastainingofouterrootsheathcellsofgreygoatinvitro(x200)3．1．3传代培养的毛囊外根鞘细胞的生长特性传代培养的ORSC与其原代细胞在形态及生长速度上均无明显差异，细胞生长与分裂依然十分旺盛。单层细胞传代约一周后便可重新长成单层，其对于胰蛋白酶消化的敏感性也较原代培养细胞明显增强。从体外培养的ORSC对数生长期的生长曲线可以看出，细胞贴壁生长的前2天为迟缓期；第3～5天为对数生长期；第5天后便进入平稳期和衰退期(图3．3)。细胞群体倍增时间为51．9h，说明ORSC经传代培养后其生长与分裂能力依然旺盛(表3．1)。表3．1青山羊毛囊外根鞘细胞接种7天的细胞密度Table3一lORSCdensityculturedforSCVCI'Idaysofgreygoat单位：×104个·mLJ时间孔1孔2孔3平均密度TimeWell1、)l，ell2Well3Averagedensityo0dl11．0l1．003333}争1d0．920．930．923333b×2d4．84．784．793333。魁3d14．9814．9614．97船婴4d54．0255．3456．8755．41蒙5d90．5690．2690．6190．476676d9696．3296．1016677d95．4595。496．3295．72333时同图3-3青山羊毛囊外根鞘细胞生长曲线Fig．3-3Growthcurveofouterrootsheathcells3．1．4山羊毛囊外根鞘细胞的染色体分析选取稳定传代的细胞，进行染色体标本计数。结果表明，济宁青山羊染色体为2n=60的细胞占主体(图3-4a)，但是个别细胞的染色体发生缺失与丢失，出现了典型的非整倍体性细胞系染色体特征，说明体外培养环境对细胞的遗传稳定性有影响作用。然而，在选取进行计数培养细胞中，拥有60条染色体的细胞数仍可占总细胞数的58．3％(图3-4c)，且这些细胞的核型与青山羊体内采集的淋巴细胞核型一致。因此，本研究所分离得到的细胞其种属来源确为济宁青山羊(图3舶，d)。 山羊毛囊细胞分离培养与鉴定及毛囊体外重塑研究：，，j●√，～，～，li：，=．4l，，一，．，：，二。、■、鬈簪j‘．1．1‘1‘11‘‘‘‘_■-●·一●■■●■1■■48505l52545556575E596061626364chmmo∞menumberCj，1ll{123lIl789》lll垂131415I●Itl192021●●●-妻I252627il簟·456i葱薹Il101112I，Ill叠161718l-●l●●222324一I毒2829X图3．4毛囊外根鞘细胞的染色体分析Fig．3-4Chromosomeanalysisofouterrootsheathcells3．1．5山羊毛囊外根鞘细胞免疫细胞化学鉴定应用免疫细胞化学染色技术检测体外培养的ORSC的骨架蛋白一细胞角蛋白19(CKl9)表达情况，并以青山羊真皮成纤维细胞和小鼠胚胎成纤维细胞为阴性对照。显微镜观察结果显示分离培养的细胞质呈黄褐色(图3．5a)，两种阴性对照细胞胞质均未着色(图3．5b，c)，表明只有分离得到的细胞角蛋白．19表达呈阳性，而角蛋白-19为毛外根鞘细胞和皮肤干细胞的标记，因此证实本研究分离培养的细胞确为由毛囊干细胞分化来的青山羊外根鞘细胞。图3．5山羊毛囊外根鞘细胞CKl9抗原的免疫细胞化学染色(x100)Fig．3-5ImmunocytochemecaistainingofORScellsagainstCKl9(×100)3．1．6毛囊外根鞘细胞的形态回复试验将传代培养于维持培养液中的ORSC，在工作培养液和维持培养液中分别进行持续培养。一周后可观察到，在工作培养液中生长的ORSC，其形态逐渐由类成纤维样短梭I●t≯鑫8l4●-×tXf；．蠢纛7●；●峥¨；¨nM玎¨玛¨曲■叠4t■■ml垢●硷鼻鸪lI■■●●l，●弘。l坞彝n●玎l鑫；●l●警：l8嚣¨^加●砺≥lII●．．■■I，鼻，纛n●圆●巧▲l，■I■，▲-■．II■l 山东农业大学博士学位论文状细胞形态转变成上皮样细胞形态(图3．6a)，该形态与原代培养分离得到的ORSC形态一致(图3．6c)：j而ORSC在维持培养基中持续培养，其形态仍以类成纤维样细胞形态为主(图3．6b)。表明尽管更换培养体系后，ORSC@_长形态发生改变，然而其仍具有正常上皮细胞的特性。图3．6青山羊毛囊外根鞘细胞的形态回复(×100)Fig．3-6ORScellmorphologyreversiontest(xl00)3．2毛乳头细胞的分离培养与生物学特性检测3．2．1毛乳头细胞的形态学观察利用中性蛋白酶与胶原酶结合消化法分离毛乳头细胞，在完全培养液中，一般启动原代培养后8h多数毛乳头即可牢固贴壁，3~4天便可见有细胞从毛乳头边缘长出(图3-7a)。在启动原代培养的一周内，细胞生长较快，向四周呈放射状生长(图3-7b)，此时毛乳头逐渐失去其原来的形状，形成成片的细胞生长致密区。随着游离生长细胞的增多，生长速率逐渐加快，在第15天左右时，细胞进入对数生长期。此时细胞大致仍由呈放射状排列的多个细胞克隆组成，中央区细胞出现多层化并呈现凝集性生长趋势(图3-7c)。凝集性生长初期的毛乳头细胞多呈多角形或长三角形，尤其是凝集团中央区的细胞，周边区细胞则多呈梭形，形态近似成纤维细胞，但前者胞体较大。此时细胞经胰蛋白酶消化处理转移到细胞培养瓶中继续培养，形成良好单层的细胞呈梭状不规则排列，形成良好单层的毛乳头细胞经Giemsa染色后，可见细胞质呈淡蓝色，胞体近中央处可见具有1~2个核仁的细胞核，呈深蓝色(图3-7d)。观察处于对数生长期的DPC，视野中可见较多量的有丝分裂相细胞，采用该染色法可较清晰的显示出细胞分裂的不同时相(图3．7e，f)。传代后的个别毛乳头细胞依然具有凝集性生长特性，凝集生长的毛乳头细胞形成类似最初分离出的毛乳头，随着传代培养的进行，其凝集性生长现象逐消失，约7代以后的毛乳头细胞基本不再出现凝集性生长现象，提示7代内的毛乳头细胞具有良好的诱导分化潜能，可用于体外毛囊重塑相关研究。 山羊毛囊细胞分离培养与鉴定及毛囊体外重塑研究图3．7体外培养的青山羊毛乳头细胞形态及Giemsa染色(×100)Fig．3-7MorphologyofDPC的mgreygoatinvitroandGiemsastainingofdermalpapillacells(×100)3．2．2毛乳头细胞克隆形成率毛乳头细胞以不同密度接种于培养瓶中，4~5天后在显微镜下可明显观察到形成了细胞克隆，经统计计算发现，本实验培养的毛乳头细胞可在较小的接种密度条件下形成众多细胞克隆，其细胞克隆形成率较高，平均克隆形成率达60％，表明细胞增殖能力强，活力旺盛。然而，若接种密度太小(小于5个／mL)，形成的细胞克隆过少，观察计数误差大，统计结果实际意义不大。反之接种密度太大(大于100个／mL)，细胞贴壁增殖后形成的克隆边界不清，难以计数。因此，在本实验中，选取了10个／mL、20个／mL、40个／mL、80个／mL四个接种密度，既利于显微镜下观察计数，又可保证所得数据能够真实反映毛乳头细胞的克隆形成率(表3—2)。表3-2毛乳头细胞在不同接种密度下的克隆形成率Fig．3．2Cloninge位ciencyofDPCinthedifferentinoculumdensities细胞接种密度(个／mL)Inoculumdensities(cells／mL)10204080·山羊毛乳头细胞的平均克隆形成率为60％。+CloningefficiencyofDPCfromgoatwas60％． 山东农业大学博士学位论文图3-8体外培养的青山羊毛乳头细胞克隆形态(×100)Fig．3-8CloningmorphologyofDPCfromgreygoatinvitro(×100)3．2．3毛乳头细胞的种属来源及组织来源鉴定选取稳定传代的细胞，进行染色体标本计数。结果显示，济宁青山羊染色体为2n=60的细胞占主体，但是个别细胞的染色体发生缺失与丢失，出现了典型的非整倍体性细胞系染色体特征，说明体外培养环境对毛乳头细胞的遗传稳定性有影响作用。然而，在选取进行计数培养细胞中，拥有60条染色体的细胞数仍可占总细胞数的76．7％(图3．9a)，且这些细胞的核型与青山羊体内采集的淋巴细胞核型一致。因此，本研究所分离得到的毛乳头细胞其种属来源确为济宁青山羊(图3．9b)。淳*jrjjjojj≤蕊震鬻曩||||||46●一二二-二l1z‘lz一一一_-一● 山羊毛囊细胞分离培养与鉴定及毛囊体外重塑研究结果表明本研究分离培养的细胞确为毛囊真皮源性的青山羊毛乳头细胞。DermaIpapillaceilsDermalfibroblestsEpithetalcells图3．10体外培养的青山羊毛乳头细胞的免疫细胞荧光染色鉴定Fig．3—10]mmunofluorescencestainingofDPcellsfromgreygoatinvitro3．3济宁青山羊真皮成纤维细胞的分离培养与鉴定3．3．1原代外植法培养细胞的形态学及Giemsa染色的观察结果利用原代外植法与冷酶消化法分离真皮成纤维细胞，在完全培养液中，钆5天便可见真皮组织小块边缘向外游离生长出单个细胞，细胞呈圆形，随后伸展成多角形的形态(图3．1la)。培养一周左右即可明显看到大量细胞从外植块边缘生长出来(图3．1lb)。随着游离生长细胞的增多，生长速率逐渐加快，在第12天左右时，细胞进入对数生长期。在倒置相差显微镜下观察，可见游离出的真皮成纤维细胞以长梭形和多角形为主，细胞饱满，透明度高，胞体向外伸出2~4个片足，胞核卵圆形，胞质较少。随后细胞向四周呈放射状生长，形成致密单层后细胞变化为梭状平行排列(图3．1lc)。纯化的真皮成纤维细胞经Giemsa染色后，可见细胞形态均一，呈梭状或长条状，对数生长期后的DFB能够形成良好单层，漩涡状或平行排列(图3．11d，e)。高倍镜下观察，细胞质呈淡蓝色，胞体近中央处有椭圆形的细胞核，呈深蓝色，其中可见2~4个核仁，细胞轮廓清晰，伸展良好，细胞间排列紧密规则。当培养瓶内的细胞形成单层后，经染色可见大部分细胞出现接触抑制，停止分裂。采用Giemsa染色法可使细胞质与细胞核具有强烈的颜色对比性，能够较清晰的显示出细胞的形态以及分裂的不同时相，从而有效 山东农业大学博士学位论文判断细胞的生长状态与健康状况(图3．1lf)。图3．1l体外培养的青山羊真皮成纤维细胞(×100)Fig．3—1lDermalfibroblastsofgreygoatinvitro(×100)3．3．2传代培养的真皮成纤维细胞的生长特性传代培养的DFB与其原代细胞在形态及生长速度上均无明显差异，细胞生长与分裂依然十分旺盛。单层细胞传代约5天后便可重新长成单层，其对于胰蛋白酶消化的敏感性也较原代培养细胞明显增强。从体外培养的DFB对数生长期的生长曲线可以看出，细胞贴壁生长的前2天为迟缓期；第3～5天为对数生长期；第5天后便进入平稳期和衰退期(图3．12)。细胞群体倍增时间为48h，说明DFB经传代培养后其生长与分裂能力依然旺盛。4d5d6d7d8dTime图3．12山羊真皮成纤维细胞生长曲线Fig．3—12Growthcurveofdermalfibroblasts2●8642Ol0O0(10 山羊毛囊细胞分离培养与鉴定及毛囊体外重塑研究3．3．3山羊真皮成纤维细胞的染色体分析随机选取60个青山羊真皮成纤维细胞，进行染色体标本计数。结果表明，虽然个别细胞的染色体发生缺失与丢失，出现了细胞染色体数目的非整倍体性特征，但是染色体为2n=60的细胞仍占主体。细胞染色体数目的分布范围在49～64之间，尽管体外培养环境对细胞的遗传稳定性产生一定影响作用，但拥有60条染色体的细胞数仍可占总细胞数的85％(图3．13a)，且这些细胞与体内正常组织细胞相比，其核型亦正常(图3—13b)。因此，上述结果说明所培养的真皮成纤维细胞其种属来源为济宁青山羊且细胞具有良好的遗传稳定性，可应用于进一步的实验研究。51鼍lI’llll^I-，ll，·ll蠢l^Ill101112789¨“^●¨¨¨161718131415_I●●¨¨●彝2223241920211l121···-●I一。．_⋯一‘●●●●3．3．4微生物污染检测结果通过显微镜及肉眼比对观察显示，体外培养的DFB无异常变化，培养液清亮，显微镜视野中无其它生物繁殖(图3—14a，b)，而阳性对照细胞培养体系明显混浊，且有大量细菌和真菌菌丝生长繁殖(图3．14c，d)，因此证明所分离培养的真皮成纤维细胞不存在细菌及真菌污染。应用PCR技术对支原体16s．rRNA基因保守区域的特异性片段进行扩增，检测第56代DFB支原体污染情况，琼脂糖凝胶电泳结果显示检测样品与阴性对照相同，在290bp处未出现特异性条带，而阳性对照在290bp处出现清晰条带(图3．14e)。由此说明DFB未受到支原体污染。综上结果，本研究分离培养的真皮成纤维细胞能够保证培养物洁净，无微生物污染。 山东农业大学博士学位论文图3．14青山羊真皮成纤维细胞的微生物污染检测Fig．3-14TestforpresenceofmicroorganismsinDFBfromgreygoat3．3．5细胞活率与贴壁率的测定结果利用血球计数板测定细胞冻存前24h的平均活率及细胞复苏后24h的平均活率与贴壁率，统计分析结果表明，青山羊真皮成纤维细胞冻存前和复苏后平均活率分别为94．4％和92．1％(图3．15a，c)，复苏6h后约有85％细胞贴附瓶底生长(图3．15b)。由此可见，冻存和复苏对传代细胞活力状况的损害较小，细胞生长状态良好。图3-15冻存前与复苏后的山羊冥皮成纤维细胞(×100)Fig．3-15DemJalfibroblastsofgoataftercryopreservation(x100)一3．3．6四种荧光蛋白质粒转染DFB效果转染24、48、72h后，分别将细胞置于特定波长激发光下用荧光倒置显微镜观察，结果显示，4种荧光蛋白均能在体外培养的DFB中得到良好的表达。4种质粒之间的转染效率相比：AcGFPl获得的转染效率在3个时间点(24、48、72h)均为最高(图3．16b)，其次为pEGFP-N3(图3．16a)，pECFP-N1在3个时间点的转染率相对最低(图3．16d)。酱■“鲻一“ 山羊毛囊细胞分离培养与鉴定及毛囊体外重塑研究对不同时间的转染率进行比较：4种质粒在转染48h的转染率均达到最高，此后随着转染时间的延长转染效率明显降低(表3．3)。然而总体水平表明，aS荧光蛋白质粒在DFB中均获得较高的转染率和基因表达率，说明本研究培养的真皮成纤维细胞活力旺盛、基因表达调控功能正常且对转染试剂的细胞毒性具有较强的耐受能力，能够满足转基因、体细胞克隆等相关研究的需要。表3．34种荧光蛋白表达载体对于体外培养的青山羊DFB的转染效率Table3-3Transfectionefficienciesoffourfluorescentproteinsingreygoatdermalfibroblasts·分别在细胞转染24、48和72h后，置于倒置荧光显微镜下观察并检测转染效率(激发光波长分别为488、543和405nm)。+Cellswereexamined24，48and72haftertransfectionusingainvertedfluorescencemicroscopewithexcitationwavelengthsof488，543and405nmtodeterminethetransfectionefficiency．图3．164种荧光蚩自在体外培养的山羊真皮成纤维细胞中的表达(x200)Fig．3-16TheexpressionanddistributionoffourfluorescentproteinsinJining伊eygoatdermalfibroblasts(x200)3．4体外重塑毛囊组织培养体系的建立3．4．1体外重塑毛囊的生长形态观察将分离的毛乳头细胞、真皮成纤维细胞混悬液加入复合鼠尾胶原凝胶中，制成毛囊真皮细胞胶原凝胶，待DPC与DFB形成良好单层后，表面再接种毛囊外根鞘细胞混悬液，进行气．液界面培养。倒置显微镜下观察：在接种外根鞘细胞后第三天，毛乳头细胞即呈现凝集性生长趋势，而表面的毛囊外根鞘细胞亦呈集落样散在分布于真皮成纤维细胞层中(图3．17a)。接种后第五天，毛乳头细胞进一步凝集性生长，部分外根鞘细胞集落通过凝胶中的真皮成纤维细胞单层迁移聚集在毛乳头细胞团周围，并不断包绕(图3．17b)。至第七天，由毛乳头细胞和外根鞘细胞经相互诱导，分化形成了圆球样的类毛球结构贴附在真皮成纤维细胞层上，而在类毛球结构周围的真皮成纤维细胞同样在诱导38 山东农业大学博士学位论文作用下大量增殖，对类毛球起到营养与保护的作用(图3．17c)。经过10天的体外培养，由几种毛囊细胞形成的圆球状结构逐渐向外围拉伸扩张，内部的毛乳头细胞向一端迁移生长，表面的外根鞘细胞继续在凝胶中移动，不断聚集在毛乳头细胞周围。培养15天后两种细胞生长增殖更加明显，原来的毛球样结构经进一步伸展延长转变成类毛囊结构(图3．17d)，并有毛纤维从基部长出，部分生长出的毛纤维颜色为浓黑色，内含黑色素(图3—17e，f)。随着气液培养的持续进行，毛纤维的长度不断的增加，个别毛纤维可达肉眼可见的长度。图3-17体外重塑毛囊不同时期的形态观察Fig．3-17Morphologyofreconstitutionofhairfollicleindifferentphase3．4．2体外重塑毛囊的组织学结构选取培养第7天、第15天和第21天的体外重塑毛囊进行石蜡切片H．E．染色，与3日龄济宁青山羊羔羊皮肤毛囊组织结构进行比较：培养7天后，毛囊真皮细胞与表皮细胞相互作用，细胞分别进行定向分化，形成了由多层细胞组成的同心圆样结构，且该类毛球结构中表皮细胞与真皮细胞界限明显，这与体内毛囊(毛球部)组织结构极其相似(图3．18a-c)。培养15天后，类毛球结构伸展延长成类毛囊结构，能够向外生长毛纤维，显微镜下毛乳头、毛根鞘等毛囊基本结构清晰明显，与体内毛囊显微结构相比亦非常相似，部分重塑毛囊还能够合成黑色素，使生成的毛纤维呈浓黑色，说明体外重塑毛囊中已有了黑色素细胞的分化(图3．18d-f)。培养第21天，重塑毛囊继续发育，毛纤维继续延长，其细胞层次分明，表层为外根鞘细胞分化的多种毛囊表皮细胞层，内层为39 山羊毛囊细胞分离培养1j鉴定及毛囊体外重塑研究毛乳头细胞及部分真皮成纤维细胞分化的毛囊真皮细胞层，中心为含黑色素的毛纤维，基部具完整的毛乳头组织，其整体结构与体内毛囊组织结构一致(图3—189-i)。上述结构说明，本研究建立的体外重塑毛囊具备体内毛囊的正常生理结构。图3．18体外重塑毛囊与体内毛囊的H．E．染色Fig．3-18H．E．stainingofreconstitutionofhairfollicleinvitroandthehairfollicleinvivo 山东农业大学博士学位论文a．经7天体外培养形成的类毛球显微形态；b．经H，E．染色后的类毛球结构；C．经H．E．染色后体内正常毛球结构；d．培养第15天形成的体外重塑毛囊形态；e．培养15天体外重塑毛囊经H．E．染色后的组织结构；f=经H．E．染色后体内正常生长期毛囊组织结构；g．培养21天体外重塑毛囊形态；h．培养21天体外重塑毛囊经H．E．染色的组织结构；i．经H．E．染色后体内正常毛囊组织结构。a．Morphologyofhairbulbliketissueduring7claysinvitro；b，H．E．stainingofhairbulbliketissueinvitro；C．H．E．stainingofthenormalhairbulbinvivo；d．Morphologyofreconstitutionofhairfolliclein15thdayinvitro；e．H．E．stainingofreconstitutionofhairfolliclein15thdayinvitro；￡H．E．stainingofthehealthyhairfollicleattheanageninvivo；晷Morphologyofreconstitutionofhairfolliclein21thdayinvitro；h．H．E．stainingofreconstitutionofhairfolliclein21thdayinvitro；i．H．E．stainingoftheheathyhairfollicleinvivo．3．2．3体外重塑毛囊与体内分离毛囊毛纤维生长速度的测定与比较将相同培养条件下3组体内分离毛囊(1～3组)与3组体外重塑毛囊(4“组)毛纤维每天的长度及其生长速度的观察测量和分析比较结果列于图3．19和表3．4。Ul哑国G4G5G6分爨I图3．193组体内分离毛囊与3组体外重塑毛囊毛纤维生长速度比较Fig．3-19Conparisonof3groupshairfolliclesinvivoand3groupsreconstitutionofhairfollicles011thegrowthrate注：Gl-G3分别为3组体内分离毛囊的每日平均生长速度；G4-G6分别为3组体外重塑毛囊毛纤维生长速度。Note：GI-133weretheaveragegrowthrateof3groupshairfolliclesinvivoeveryday；G4-G6weretheaveragegrowthrateof3groupsreeonstitutionofhairfolliclesinvitroeveryday．山羊体内毛囊与体外重塑毛囊经体外培养9d后，通过对毛囊生长速度的观察测量和统计分析发现：体内毛囊在含EGF、5ng／mLbFGF和5％FBS的MEM与DMEM／F12(1：1)混合培养液中培养，前3天其毛纤维每日平均生长速度略低于体外重塑毛囊，为0．112mm／d(体外重塑毛囊为0．163mm／d)；从第4天到第9天体外重塑毛囊毛纤维生长速度与体内毛囊达到一致，为0．153mm／d和o．161mm／d；当培养时间超过9天，体外重塑毛囊继续生长，而体内分离毛囊逐渐失去原有组织形态和结构，直至萎缩凋亡。推测前3天体内毛囊毛纤维生长速度略低于体外重塑毛囊原因在于从体内机械分离毛囊时，对毛囊细胞造成了轻微的损伤，导致起初培养阶段部分游离毛囊进行组织损伤修复，影响毛纤维生长速度。利用SAS9．0统计分析软件，统计3组体内分离毛囊与3组体外重塑毛囊毛纤维的生长速度，进行差异显著性分析，结果表明，培养9天体外重塑毛囊毛41蛇蜷MH抡¨惦帖舛吃oO0O—I)＼宣暑一秘～涮f|∥一11一o_0， 山羊毛囊细胞分离培养与鉴定及毛囊体外重塑研究纤维生长速度与体内毛囊差异不显著(P
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