资源描述：
《毛囊外根鞘细胞分离培养及鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、毛囊外根鞘细胞分离培养及鉴定［摘要］目的建立毛囊隆突处外根鞘细胞的分离和培养方法。方法利用中性蛋白酶分离得到单个毛囊，采用胰酶消化法进行细胞培养，倒置6显微镜观察细胞形态，绘制细胞生长增殖曲线，免疫荧光检测干细胞相对特异性标识分子角蛋白19(K19)和B1整合素表达情况，分别用分离培养的角质形成细胞(Keratinocytes,KCs)做对照。结果免疫荧光检测显示90%左右的毛囊外根鞘细胞胞浆中均有K19和B1整合素的阳性表达。结论应用中性蛋白酶和胰酶消化法体外培养毛囊隆突处外根鞘细胞简单、可行。［关键词］毛囊；外根鞘细胞
2、；毛囊干细胞；角质形成细胞；分离；培养［中图分类号］R392.2［文献标识码］A［文章编号］1673-9701(2013)06-0001-03毛囊的上皮由表皮延伸而来，主要分为外根鞘(outerrootsheath,ORS)和内根鞘(innerrootsheath,IRS),外根鞘相当于表皮的基底层和棘细胞层。皮脂腺下部的外根鞘通常称为隆突部［1］,该隆突部位目前被认为是毛囊干细胞(hairfolliclestemcell,FSC)存在的主要部位［2］。Hong等［3］将人FSC在黑色素细胞分化培养基中培养14d,其中有2
3、0%〜40%的细胞出现了黑色素细胞特有的树枝状形态等特点。因此分离毛囊隆突部的ORS细胞即获得具有向黑素细胞分化的FSCoK19、Bl整合素［4-6］等被认为是皮肤干细胞的标志。我们通过免疫荧光检测毛囊0RS细胞胞浆中K19和B1整合素的阳性表达以证实其干细胞的特性。1材料与方法1.1材料皮肤外科手术切除的成人头皮15例；分离毛囊的器械包括眼科剪刀、镶子、解剖显微镜和显微器械；中性蛋白酶（dispase,Gibco）；胰蛋白酶-EDTA（Gibco）；无血清角质细胞培养基（K-SFM,Gibco）；表皮生长因子和牛垂体添加
4、物；红细胞计数仪。1.2方法1.2.10RS细胞的分离、培养参考文献［7,8］,将皮肤外科手术切除的成人头皮用PBS液清洗2次，尽量去除皮下脂肪，再用PBS液清洗2次，将头皮切成细长条并分成3〜5个毛囊的小块，在解剖显微镜下用无菌手术刀片在皮脂腺下方（约表皮侧1/5〜1/4处）横切毛囊（切去的表皮侧留做KCs的分离、培养），并将去除表皮侧的毛囊置入含0.25%Dispase酶的试管中，37°C消化50〜100min（肉眼见标本稍变毛糙）后用PBS液清洗1次，解剖显微镜下收集形态完好的生长期毛囊，用眼科蹑轻轻挤出毛囊（不包含
5、毛乳头），放入试管A，加DMEM培养基清洗，1000r/min离心5min,加入0.25%的胰酶-EDTA37°C孵育15min左右，加入10%的胎牛血清（FBS）终止消化。静置1min后毛囊沉入离心管底，取上清液至试管B。试管A加0.25%的胰酶-EDTA37°C孵育10min左右，重复上述过程一次，以增加分离的0RS细胞数。将试管B内的液体离心，用添加了表皮生长因子和牛垂体添加物的K-SFM培养基重悬细胞，计数，37°C.5%C02孵箱培养，2〜3d换液。1.2.2KCs的分离、培养被去除的表皮侧头皮加入0.25%Di
6、spase酶分离表真皮，将表皮加入0.25%的胰酶-EDTA37°C孵育5min左右，加入10%的FBS终止消化，离心获得KCs,用添加了表皮生长因子和牛垂体添加物的K-SFM培养基重悬细胞，计数，37°C.5%C02孵箱培养，用作与ORS细胞的鉴定做对照。1.2.30RS细胞与KCs的传代0RS细胞培养10〜12d,KCs培养8〜10d生长至汇合，分别以0.05%胰酶379消化细胞1〜3min,10%的FBS终止消化，收集细胞悬液离心（1500转，5min）,弃上清，加入新鲜培养液，重悬细胞，计数。1.2.4倒置显微镜观
7、察KCs与0RS细胞的生长情况分别于原代培养的第2天、第5天及细胞生长至汇合拍摄照片,以观察细胞生长的动态，比较二者的异同。1.2.5四甲基偶氮13坐蓝比色法（MTT法）行细胞增殖测定并绘制细胞生长增殖曲线选择对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化5〜8min,调整细胞浓度为5X104/mL加于96孔培养板，每孔100uL,再分别加入不同浓度药物（1.5、1.8、2.2、2.5、2.8、3.2mg/mL）,并设置培养液对照。置37°C、5%C02条件下培养56〜72h,于结束前4h加入MTT10nL/孔，4h后弃上清液，加入
8、二甲基亚矶（DMS0）100uL/孔,振荡10min左右，置酶标仪测A值，波长为570nmo1.2.6免疫荧光检测进行干细胞特性的鉴定分别将第2代0RS细胞与KCs爬片行K19、B1整合素的免疫荧光检测,分析0RS细胞是否具有干细胞的特性。2结果2.1细胞的形态学观察KCs（图1）呈特征性铺路石样生长，
