小鼠胰星状细胞的分离培养及鉴定

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1、小鼠胰星状细胞的分离培养及鉴定唐元瑜苏式兵上海中医药大学屮医复杂系统研究屮心（上海201203）第一作者简介：唐元瑜，男，1971—10—24生，四川省攀枝花人，汉族.屮医临床皋础专业博上，主要从事中医药防治器官纤维化研究。通讯作者：苏式兵，201203,上海浦东新区蔡伦路1200号，屮更复杂系统研究中心，E-mail：shibingsu@yahoo.com,Tel/Fax:021—51323013。基金资助项目：1・上海市教委项目（07ZZ51）；2.上海市教委E-研究院中医内科建设计划资助项bl（E03008）o【摘要】

2、目的：通过运用植块法与酶消化法结合分离小鼠胰腺星状细胞（PSCs）以期建立简单易行的PSCs原代培养方法，为按腺纤维化研究提供可靠的体外细胞模型。方法：无菌条件下取小鼠胰腺组织，经过剪碎、胰蛋口酶消化后植入培养瓶屮贴壁培养，并予限制性条件培养基进行纯化，通过倒置生物显微镜对传代诞后所培养细胞进行形态学观察、自发荧光、油红染色脂滴及细胞免疫化学或荧光等方法來鉴定小鼠胰星状细胞。结果：小鼠原代PSCs培养3-4天后汕红染色阳性，并能观察到白发荧光现象；传代后的细胞形态主要表现为体积较大，伪足发达，成“星芒状”或“乌贼样”，细胞免

3、疫荧光法示。-平滑肌肌动蛋白（a-SMA）表达阳性，DAB细胞免疫化学染色示胞浆呈典型的棕褐色。结论：植块与胸消化结合法分离小鼠胰腺星状细胞，简单实用、成功率高，能够满足体外实验的要求。【关键词】胰星状细胞；培养；鉴定；植块法0引言慢性胰腺炎是临床消化系统疾病中的常见病，其主要的病理特征改变包括不同程度的腺泡破坏，胰腺间质纤维化，导管扩张，囊肿形成等（门。1=1前国内外学者一致认为胰星状细胞的活化是胰腺纤维化形成的屮心事件，所以活化的星状细胞是研究胰腺纤维化形成的主要效应细胞“。目前分离和培养胰星状细胞的经典方法是酶灌注消化

4、法，但这种方法，耗时耗力，影响实验的研究进展，与肝纤维化研究相比，胰腺纤维化的研究已明显落伍，其关键的重要原因z—•就是缺乏适合研究胰腺纤维化的体外细胞模型®。虽然国内已有大鼠胰星状细胞成功分离培养的报道，但迄今国内外尚未见到小鼠胰星状细胞的原代培养报道，所以，木研究旨在通过建立一种新的简单易行、重复性高的小鼠胰星状细胞的分离培养方法以提高工作效率，为卜•一步开展胰腺纤维化研究奠眾实验工作基础。1材料和方法1.］材料1.1.1实验动物清洁级昆明种小鼠，体重20克，雌雄不限，由上海屮医药大学动物实验屮心提供；实验前口出进食、饮

5、水。1.1.2主要试剂与仪器M199培养基（Gibco公司，批号:1279324）、胎牛血清（杭州四季青生物工程公司，批号：080626）>L型一谷氨酰胺（Amresco生物公司）、小鼠平滑肌肌动蛋白（a-SMA）单克隆抗体、小鼠结蛋白（desmin）单克隆抗体、FITC标记羊抗小鼠IgG抗体（以上三种抗体均出武汉博士德生物有限公司提供）、I1RP标记的羊抗小鼠IgG抗体（北京博人泰克生物基因技术有限公司）、油红0染料（上海晶美生物有限公司）。美国Therma一氧化碳培养箱、日本ObmpusCK41倒置荧光显微镜及DP-70

6、成像系统、徳国Eppendorf高速冷冻离心机。1.2方法1.2.1小鼠胰星状细胞的分离与培养参考国外学者Kruse.Marie^Luise等®及国内吴凯、王兴鹏等⑺培养胰星状细胞的方法，对其进行改良，主要包括取胰、消化、植块及纯化培养等步骤，其中纯化所用的培养基为含有胎牛血清、蛋门酶抑制剂、促细胞生长因了的M199限制性条件培养液。1.2.2小鼠胰星状细胞的鉴定主要包括细胞形态学，口发荧光，脂肪滴的观察及细胞骨架蛋口标志物的检测四个方面内容。(1)形态学观察采用Olympus倒置生物显微镜，观察胰星状细胞的形态结构，主要包

7、括胞浆内的脂滴、细胞的伪足及细胞核等，每天一次。(2)自发荧光观察采用Olympus荧光显微镜，在波长为328nm的紫外光激发下进行观察，时间从原代培养的第三天开始。(3)叮喘橙(A0)染色观察取对数生长期的传代细胞，弃培养液，用预冷PBS液漂洗贴壁细胞2遍后，滴加终浓度为100ug/mlU丫喘橙荧光染液5滴，迅速在荧光显微镜卜•蓝色光激发观察细胞形态。(4)脂肪滴观察主耍采用油红0染色法，在观察到细胞自发荧光现象时立即进行染色，即将培养细胞予10%甲醛溶液固定15分钟后，用磷酸缓冲液漂洗细胞2遍以洗去残余固定液，然后滴加0

8、.5%油红0染液覆盖细胞表面，常温下染色45分钟后即进行染色细胞脂肪滴观察并摄影成像。(5)骨架蛋口染色观察运用细胞免疫荧光及化学染色法，对传代后所培养的细胞进行Q-SMA骨架蛋白的染色观察。方法按照武汉博止德生物公司提供的说明书步骤进行，其'I'<1-SMA单克隆抗体、FITC标记的羊抗