小鼠胚胎肠神经嵴干细胞的分离培养及鉴定

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1、小鼠胚胎肠神经嵴干细胞的分离培养及鉴定作者：肖莉,刘勇,高亚单位：西安交通大学医学院：第二附属医院小儿外科，陕西西安；环境与疾病相关基因教育部重点实验室，陕西西安【摘要】目的建立分离培养及鉴定小鼠肠神经嵴干细胞(gutneuralcreststemcells,GNCSCs)的方法，为临床应用奠定基础。方法分离胚鼠肠管，消化后接种于添加N2、B27和碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基，贴壁培养；连续传代后用血清促进GNCSCs分化；最后用免疫细胞化学方法染色鉴定。结果分离培养的细胞聚集生长，形

2、成的克隆球可以传代；克隆球p75染色阳性；分化后的细胞分别表达肠神经元、神经胶质细胞和平滑肌细胞特异性抗原。结论分离培养的克隆球具有自我更新和多向分化的能力，表达肠神经嵴干细胞的特异性抗原p75，是肠神经嵴干细胞。【关键词】肠神经嵴干细胞；胚胎小鼠；细胞培养；细胞分化；先天性巨结肠症　　Isolationandcultureofneuralcreststemcellsofembryonicmiceinvitro　　XiaoLi,LiuYong,GaoYa　　(DepartmentofPediatricS

3、urgery,theSecondAffiliatedHospital,MedicalSchoolofXianJiaotongUniversity,Xian710004;theKeyLaboratoryofEnvironmentand　GenesRelatedtoDiseasesofMinistryofEducation,MedicalSchoolofXianJiaotongUniversity,Xian710061,China)　　ABSTRACT:ObjectiveToestablishasa

4、tisfactorymethodofisolating,culturinganddetermininggutneuralcreststemcells,whichmayprovidetheoreticalbasisforclinicalapplication.MethodsThegutsofembryonicmiceremovedanddissociatedwereplatedintoserumfreeDMEM/F12medium.ThemitogenfreeDMEM/F12mediumsupplem

5、entdwith10%fetalbovineserumwasusedtoinducedifferentiationofGNCSCs.Neurospheresandtheirderivationsweredeterminedwithimmunocytochemicalandimmunofluorescentstaning.ResultsNeurospheresweregeneratedinthesimplifiedserumfreemedium.Thestainingresultsshowedthate

6、ntericneurosphereswereGNCSCsandcoulddifferentiateintoneurons,glialcellsandsmoothmusclecellsbyseruminduction.ConclusionGNCSCshavethecapacityofselfrenewalandproliferation,andgiverisetoneurons,glialcellsandmyofibroblasts.　　KEYWORDS:gutneuralcreststemcell;

7、embryonicmouse;cellculture;celldifferentiation;hirschsprungdisease　　先天性巨结肠症(hirschsprungdisease,HSCR)是小儿常见的先天性消化道畸形之一，表现为肌间神经节和黏膜下神经节的节细胞缺如。传统手术以及近年推广的新生儿、婴儿Ⅰ期经肛门根治术或腹腔镜根治术虽然提高了巨结肠的治疗效果，但其术后的并发症严重影响患儿的生活质量[1]，因此迫切需要探寻一种创伤小、远期效果更好的新型治疗方法。在本研究中我们通过细胞培养和免疫组

8、织化学方法来研究胚胎肠神经嵴干细胞(GNCSCs)的生理特性及其分化功能，旨在将其用于临床治疗先天性巨结肠症。　　1材料与方法　　1.1试验动物怀孕14-17d昆明小白鼠10只，体重不拘，第四军医大学实验动物中心提供。　　1.2仪器与试剂细胞培养主要仪器：ESPEC恒温二氧化碳培养箱和OLYMPUS倒置显微镜。DMEM/F12完全培养基(Gibco)组成：B27添加剂(Gibco)、N2添加剂(Gibco)、重组人碱性成纤维细胞生长因子(b