大鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定

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1、大鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定【关键词】胚胎【摘要】目的：探讨胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定方法。方法：原代培养、培养细胞生长状况观察、组织化学鉴定、流式细胞仪进行细胞凋亡分析。结果：准确分离出了神经干细胞，了解其生长规律及细胞凋亡的情况。结论：用此方法分离胚胎神经干细胞实用、便捷和可行。【关键词】大鼠;胚胎;神经干细胞Extraction、CultureandAppraisaloftheRatEmbryoNeuralStemCellsJIShengpu,WEIHuipingHebeiNorthUniver

2、sity，Zhangjiakou，075000，China【ABSTRACT】Objective:Tomasterextraction、cultureandappraisaloftheratembryoneuralstemcellsinitiallybyexperiment,Inthispaperthegrowthruleandapoptosisofembryoneuralstemcellswerestudied.Methods:thegrowthcycleandgrowthstateforprimarycultu

3、reneuralstemcellswereobservedcarefully,andapoptosiswasanalyzedwithhistochemistryidentiticationandFCM(flowcytometry)aswell.Results:investigatedthororghlyTheneuralstemcellswereabstractedaccurately,andtheirdevelopmentcycleandapoptosisconditionwereinvestigatedthor

4、oughly.Conclusion:Theresultabovecanprovidereliableevidencetoobtainagreatquantityofneuralstemcells.　【KEYWORDS】rat;embryo;neuralstemcells干细胞具有可再生为各种组织、器官的潜能，将其分离并使之向特定方向分化，就可以用健康组织代替病变组织，治疗心肌梗死、糖尿病等组织坏死性疾病、退行性病变、自体免疫性疾病等。神经干细胞（neuralstemcells,NSCs）是具有增殖和分化潜能的原始神

5、经细胞，它能分化成神经组织的各种细胞，如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等，并能自我更新，甚至能终身存在于神经系统之中。NSCs在理论和临床上都具有巨大的价值，我们知道，脑老化可能是神经系统退变性疾病的初级阶段，与疾病的发生有着相同的基础，目前已用NSCs治疗神经系统退变性疾病，并且也用于脑老化的治疗。为此我们需要大量的神经干细胞，本课题选取大鼠胚胎神经干细胞，探讨其分离、培养、鉴定的方法，并探讨其体外生长的生物学特性。1材料和方法1.1材料培养基：小牛血清，天津生物制品研究所；DMEM/F12培养基；EGF、b

6、FGF、辅助培养基等均购自北京试剂商店。实验动物：20d大鼠胚胎，由河北北方学院动物中心提供。1.2方法原代培养取材：在无菌室内取孕鼠新鲜子宫，用烧杯盛之，用75%酒精浸泡，严格无菌的条件下，取出胚胎，剪开头皮，撕去脑膜，掀开大脑皮层，分别取侧脑室部位和大脑皮层脑组织，用Hanks液反复冲洗，去掉血液和血块，除尽脑膜组织和结缔组织。分离细胞：将组织移入青霉素小瓶，剪碎脑组织，加入025%胰蛋白酶37℃度消化15min，然后加入含10%小牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，用200目不锈钢筛网过筛，获得单细胞悬液

7、，然后离心，获细胞沉淀（1000转/min，8min）。细胞培养：在细胞沉淀内加入1ml含小牛血清的培养基，吹打均匀，制成细胞悬液。取出一滴细胞悬液，细胞计数板计数，然后以35万/ml细胞接种到25ml培养瓶中，37℃，5%二氧化碳，95%湿度孵箱培养。24h后除去贴壁的分化细胞和沉淀杂质。分为两组：一组加入含10%小牛血清的DMEM/F12培养基；另一组换为新鲜无血清胚胎神经干细胞培养基，其组分为：DMEM/F12，20ng/mlEGF,20ng/mlbFGF，辅助培养基。培养后视培养基颜色和细胞生长状况进行稀释

8、和换液。培养细胞生长状况观察每天对细胞进行计数，随即选择10个高倍视野，取其平均值，作为每天的细胞数目指标，由此可知细胞的生长状况。每天对细胞的形态、分裂、分化情况、有无克隆球等生物学特征进行观察，记录结果。2005年6月河北北方学院学报（医学版）第3期2005年6月吉胜朴等：大鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定第3期组织化学鉴定原代培养次日换液时，取一瓶培