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《胚胎大鼠大脑额叶皮质神经干细胞分离、培养及鉴定.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、胚胎大鼠大脑额叶皮质神经干细胞分离、培养及鉴定作者：徐汉荣，晋光荣,张海军，赵连东,顾宝荣［摘要］目的：探讨从胚胎大鼠大脑额叶皮质分离培养神经干细胞(neuralstemcell,NSCs)的方法及NSCS的特性。方法：将145d胎龄的大鼠额叶皮质脑组织制备成单细胞悬液，于含EGF和bFGF的DMEM/F12无血清培养液中培养，形成原代细胞球后，进行单细胞克隆传代扩增。免疫荧光组化方法检测克隆球Nestin、Map2、GFAP抗体标记情况。结果:原代培养2周后，可形成大量悬浮生长的神经球，BrdU和Nestin检测呈阳性，诱导分化后呈Map2、GFAP阳性。结论:可
2、从胚鼠脑皮质中分离培养纯化、扩增传代获得NSCs,经诱导后可以分化为神经元和星形胶质细胞，可作为细胞替代治疗中枢神经系统疾病的供体来源。［关键词］神经干细胞;纯化;诱导分化；大鼠神经系统创伤、缺血及退行性疾病的治疗一直是困扰医学界的一个难题。人和哺乳动物体内及胚胎体内神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)的发现，为解决这一难题点燃了新的希望。目前，众多学者从各种途径探索治疗神经系统疾病的生物材料及治疗方法［12］。NSCs是一类具有自我更新和多向分化潜能的特殊细胞。利用它不仅可以探讨神经系统发育的分子机制，也可作为细胞移植治疗中枢神经系统损伤、退行性
3、疾病及脑肿瘤等疾病。胚胎期的NSCs主要位于纹状体、大脑皮质、视网膜以及脊髓等部位［1,3］,目前利用细胞培养技术已经成功地从上述部位分离出多潜能NSCso尽管NSCs是未分化细胞，不同来源的NSCs之间仍有差别。与中脑及脊髓起源的NSCs相比，纹状体及皮质NSCs更适合于细胞移植替代那些因脑内疾病受损的神经元［4］。本研究以胚胎大鼠为供体，采用单细胞克隆技术选择性分离探索了大脑额叶皮质NSCs的纯化、标记、不同诱导分化方法及鉴定技术，为进一步研究NSCs的生物学特性和NSCs移植替代治疗神经系统疾病提供生物材料及方法。1材料与方法11材料145d胎龄的SD大鼠由东
4、南大学动物实验中心提供。DMEM/F12培养基为Invitrogen公司产品，B27辅助培养基、碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)及表皮细胞生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)均为Gibco公司产品，兔抗大鼠Map2和兔抗大鼠GFAP抗体购自美国R&；D公司，其他免疫组化试剂购自北京中山公司。1.2方法121取材与培养无菌条件下脱颈处死大鼠，在体视显微镜下小心解剖大脑额叶皮质，机械剪碎,015%胰蛋白酶消化lOmin,含10%胎牛血清的完全培养液终止消化5mino滴管反复吹打成单
5、细胞悬液,1000r・；min-l离心lOmino细胞重悬于NSCs培养液，即DMEM/F12（1：1）,B27（体积分数为0.02）,EGF（20ng・；ml-l）,FGF（20ng・；ml-l）□调整细胞浓度为（4—5）X105ml-lo接种到塑料培养瓶，置于371、5%C02培养箱中悬浮培养，每3~4d更换培养液1次。待原代克隆形成后再次用机械分离法制作单细胞悬液，按5X105细胞密度接种于50ml培养瓶中，每隔7〜10d机械分离克隆传代1次，用1ml注射器（带5号针头）用力吹打混匀（同时换培养液）。采用有限稀释法单细胞克隆
6、连续传代。将细胞接种于96孔板，选取只有1个细胞的孔连续观察，将其增殖所形成的单细胞克隆机械分离成单细胞悬液，将所有细胞接种于25ml培养瓶中,待次代克隆长成后连续传代。122NSCs增殖与分化的标记鉴定克隆球Nestin鉴定:将经过多次连续传代所形成的克隆细胞球接种于预先置有多聚赖氨酸涂层盖玻片的6孔板中，培养液成分为DMEM/F12（1：1）、B27辅助培养基（1X50）、20ng・；ml-lbFGF和20ng・；ml-lEGF,培养7d后行免疫荧光细胞化学染色，观察NSCs特异性抗原Nestin的表达情况。克隆球诱导分化细胞的鉴定：将经
7、过多次连续传代所形成的克隆细胞球吹打成单细胞，调整细胞浓度为（4〜5）X105ml-1接种到含5mmol・；L-l无血清DMEM/F12（含20ng・；ml-lbFGF,20ng・；ml-1EGF及B27辅助培养液）塑料培养瓶培养形成新的神经球。将神经球接种于多聚赖氨酸包被的盖玻片的6孔板，加入20%胎牛血清的DMEM培养液贴壁生长。7d后4%多聚甲醛固定分化细胞5min,封闭液（1%山羊血清蛋白,03%TritonlOO）封闭30mino加一抗过夜,PBS漂洗3次，每次lOmin,然后加入FITC荧光素或罗丹明的相应二抗，孵
