胎鼠大脑皮层神经干细胞的分离培养、分化及鉴定.doc

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1、胎鼠大脑皮层神经干细胞的分离培养、分化及鉴定作者：胡晓霞，朱筑霞，陈刚，谭新杰【摘要】　　目的：建立胎鼠大脑皮层神经干细胞体外分离、培养、分化及鉴定的方法，探讨神经干细胞的基本生物学特性。方法：取孕14d胎鼠大脑皮层，吸管吹打机械分离制成单细胞悬液，采用无血清培养和胎牛血清诱导分化，应用免疫荧光技术鉴定神经干细胞及其分化的子代细胞。结果：从胎鼠大脑皮层分离的细胞呈神经巢蛋白（Nestin）免疫阳性并能在体外传代培养，血清诱导分化后的细胞可表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白，诱

2、导分化成的神经元能表达突触的特异性标志Synatophymin。结论：分离和培养的细胞能表达神经干细胞的特异性标志物Nestin，并且具有很强的增殖能力和多向分化潜能，属于中枢神经系统的神经干细胞。【关键词】干细胞大脑皮质细胞培养细胞分化胚胎大鼠SpragueDawley　　［Abstract］Objective:Toestablishamethodforisolation,cultivation,differentiationinduction,andidentificationofneuralstemce

3、lls(NSCs)fromembryonicratinvitro,andexplorethebasicbiologicalfeaturesofthesecells.Methods：Themesencephalonofratwithconceptusageof13dayswastakenoutanddissociatedintosinglecellsuspensionmechanically,andthenculturedinserumfreemedium.Fetalbovineserumwasusedtoi

4、nducecelldifferentiation.Theisolatedcellsandtheirprogenywereobservedbyusingimmunofluorescencetechnique.Result：Theisolatedcellsshowednestinpositivereactionandcouldbeculturedinvitroinseries.Afterbeinginducedbyfetalbovineserum,microtubuleassociatedprotein2(MA

5、P2)andglialfibrillaryacidicprotein(GFAP)whicharespecificantigensinneuronandastrocyteexpressedinthesecells,andsynatophymin,aspecificsignalofsynapse,wasalsoexpressedinthedifferentiatedneurons.Conclusion：TheisolatedandculturedcellsareNSCsofcentralnervoussyste

6、m,andpossessstrongcapabilityofproliferationandpotencyofmultidirectionaldifferentiation.　　［Keywords］stemcells;cerebralcortex;cellculture;celldifferentiation;embryo;rats,spraguedawley　　传统观念认为，哺乳动物的神经组织只有死亡，没有再生能力。自从上世纪90年代初科学家们分离、培养出神经干细胞(Neuralstemcells,NS

7、Cs）以来,人们相继从各种动物及人的中枢神经系统分离、培养了NSCs[1,2]5。NSCs的发现不仅打破了神经元不会再生的传统观念，而且为许多以往难以治疗的神经系统疾病提供了新的治疗思路和途径。2007年6月利用细胞分离、无血清培养、血清诱导分化及免疫荧光等技术，证明了本实验所分离的细胞群为NSCs，以期为进一步使用和研究NSCs奠定理论及实验基础。　　1材料与方法　　1.1材料　　DMEM/F12、B27、胎牛血清购自GIBCO公司，bFGF、Nestin抗体、突触素抗体Snaptophysin购自SIGM

8、A公司，MAP2抗体、GFAP抗体购自SantaCruzBiotechnology公司，倒置相差显微镜及荧光显微镜为NIKON公司产品。　　1.2NSCs的分离培养[3～5]　　成年雌性和雄性SD大鼠各1只,体重220～260g,雌雄合笼后,检查阴栓,见阴栓计为孕0d；孕14d时取胎鼠,在解剖显微镜下仔细分离获得胎鼠大脑皮层,再用DHanks液漂洗,用眼科剪反复切割组织,再用200目细胞筛过滤,