胎鼠额叶皮质神经干细胞的分离培养与分化.doc

《胎鼠额叶皮质神经干细胞的分离培养与分化.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、胎鼠额叶皮质神经干细胞的分离培养与分化作者：刘兵，欧微，刘洪涛单位：长江大学医学院，湖北荆州）（长江大学附属第一医院荆州市第一人民医院，湖北荆州）（长江大学医学院，湖北荆州）【摘要】目的：探索从胚胎小鼠额叶皮质分离培养神经干细胞的方法。方法：无菌条件下分离孕13〜15d小鼠胚胎额叶皮质脑组织，经消化及机械吹打成单细胞后接种于含有B27、bFGF的DMEM/F12培养基，培养扩增;倒置显微镜观察比较生长状况;机械分离法传代;10%血清接种分化;免疫细胞化学方法染色鉴定神经干细胞及其子代细胞的分化方向，结果：培养的部

2、分细胞体外分裂增殖，同时表达神经干细胞特异性抗原nestin,并向神经细胞和胶质细胞分化。结论：小鼠胚脑存在具有多分化潜能的神经干细胞，它们能在体外稳定培养、传代和分化，为细胞替代治疗提供了理想的细胞來源。【关键词】神经干细胞;培养;分化;胎鼠神经干细胞（neuralstemcells,NSCs）是一类广泛存在于胚胎及成体中枢神经系统的早期未分化细胞，被认为是神经系统的&ldquo：发源地”[1]□近年来随着对NSCs研究的深入，利用NSCs移植治疗神经系统损伤及退行性疾病越来越受到广泛的关注［2］。

3、如何将神经干细胞在体外稳定培养、传代，不仅可以为体外研究神经干细胞的分化打基础，而且可以促进神经干细胞应用于细胞替代治疗的发展。木实验在无血清培养条件下，利用特定的生长因子使胎鼠NSCs稳定增殖传代并分化出神经元和神经胶质细胞，为进一步探讨小鼠胚胎NSC移植的临床研究奠定基础。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物孕13〜15(1昆明小鼠(E13E15SPF级)由武汉大学实验动物中心提供。1.1.2试剂与抗体DMEM/F12培养基，特优级胎牛血清(FBS),B27均购口GIBCO公司(USA);碱性成纤维生长因

4、子(bFGF)购自Peprotech公司(USA);胰酶(Trypsin)、DNA酶1(DNasel)、左旋多聚赖氨酸(PLL)和DAPI购自SIGMA公司(USA)。謝E鼠antinestin,antiNSE,antiGFAP的单克隆一抗体及相应的荧光标记二抗均购自美国AlphaDiagnosticInti.Inc公司；其余试剂均为市购。一次性培养皿(直径60min)和24孔板购自美国Corning公司。1.2方法1.2.1神经干细胞的分离培养与分化取孕13~15d昆明小鼠，断颈处死，75%酒精浸浴2min,无

5、菌剖腹取出胚胎，浸于预冷0.01MPBS中，解剖显微镜下分离胎脑，PBS洗2次，剥尽脑膜，切取额叶脑皮质组织块(每次用胚胎6〜8只)。将取下组织转移至试管中，予以0.25%胰酶(Trypsin)和DNA酶37°C恒温摇床(150rpm)消化5min,用含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化，吸管轻柔吹打制成单细胞悬液，lOOOrpm离心lOmin,弃上清,以无血清DMEM/F12培养基再次重悬，200目尼龙网过滤，经台盼蓝染色计数后，调整细胞密度以3×105个活细胞接种于60mm培养皿中，加2

6、%B27、10ng/mlbFGF于37°C5%C02恒温培养箱中培养。细胞生长1周左右，采用机械方法分离传代细胞，离心弃上清液，重悬，计数接种。一般7d左右传代一次。取传2~3代的神经干细胞克隆，置入装有1%多聚赖氨酸处理过盖玻片的24孔培养板中，在仅在含有10%胎牛血清培养基中口然分化，均每2〜3d换液，培养10d后收获细胞。1.2.2免疫细胞化学鉴定将神经干细胞用含血清培养基种植到多聚赖氨酸包被的载玻片上，对贴壁3h的神经球进行Nestin染色。对有血清培养1周的神经球进行神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质

7、纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光染色。检测方法如下：取出待检细胞，纯甲醇-20°C固定20min,PBS洗3次，每次5min,0.5%TritonX100透化20min,PBS洗3次;3%H202和羊血清孵育封闭非特异性反应，PBS洗3次；一抗分别为Nestin.NSE.GFAP.4°C过夜，次日加入标记有Cy3荧光素或FITC荧光素的二抗，37°C孵育lh;PBS洗3次，缓冲甘油封片，日木OLYPUS显微镜和德国Lacai共聚焦显微镜拍片观察。2结果2.1神经干细胞的分离培养和分化情况原代培养的皮质干细胞在含B

8、27及bFGF的无血清培养基中培养，早期胞体较小，圆形，未见突起，光镜下折光性好，晶亮;24h可见大部分细胞沉底，无突起，由于取材仅限额叶皮质细胞间比较干净;36h可见沉底的细胞形成5〜10个细胞的聚集体;2天可见聚集体增大,悬浮，形成十几个细胞的神经球(neurosphere)(见第77页彩色图版I之图1),以后细胞球继续增大，5〜7d细胞球直径可达20~25μm