神经干细胞分离培养与分化调控研究进展.doc

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1、神经干细胞分离培养与分化调控研究进展刘继东①摘要白从神经干细胞特别是成体神经T细胞的发现，使人们看到利用神经T•细胞治疗神经系统损伤的曙光。神经干细胞的分离培养以及分化调控一直是基础研究的重点，本文综述了近年來这方面的研究成果，以对其有全面的了解，希望能对我们的研究工作有一定的帮助。关键词干细胞神经系统/细胞学分离培养调控［中图分类号］R329［文献标识码］A长期以來，普遍认为哺乳动物的再生仅限于胚胎时期，这意味着成年动物脑和脊髓内的神经细胞只能逐渐减少而不能被更新或替代。然而，屮枢神经细胞再生现象及具有增殖能力的神经T•细胞再生现象及具有增殖能力的神经干细胞的发

2、现向这-•理论提出了挑战。现在己经从胎鼠、成年鼠、胎儿和成人脑的皮层、室管膜下层、纹状体、海马、中脑、前脑、等脑区和脊髓分离得到了NSCo由于保持了未分化状态并具有增殖能力，因此移植NSC治疗神经退行性疾病引起了人们极人的兴趣。然而，由于神经干细胞在体内分化成为各种神经细胞的机制十分复杂，对于神经干细胞受控分化为所需成熟神经细胞的研究十分热烈，本文综述了近年来神经干细胞在分离培养分化调控的研究进展，以对其有更全面的了解。1神经干细胞的生物学特征干细胞研究始与本世纪60年代，造血干细胞的发现使人们对干细胞的特点有了一•些初步的了解。近年來，随着生物细胞实验技术的发展

3、，该领域取得了突破性进展，被«science»杂志评为2000年十大科学成就之一。T•细胞是一种未分化细胞，其基本特性为，第一具有白我复制能力，第二可分化为超过一种以上的功能细胞。根据分化潜能的大小，可将之分为3类，一是全能干细胞，即受精卵，受精后的第1小时内，受精束可分裂为功能一致的全能细胞，将其屮的任一细胞置于女性子宫内均可发育为胎儿；二是胚胎干细胞，它具有广泛的分化潜能，可生成除胎盘外机体所有的组织细胞；三是多能T细胞，它局限于器官的某些特定部位，可分化为所在组织的细胞。神经干细胞是位于神经系统的多能干细胞。传统观点认为，屮枢神经系统的神经细胞是一种终末细胞

4、，即细胞处于有丝分裂厉状态，缺乏再生能力。创伤和病理过程引起的神经原丢失丝-•个不可逆的过程。近年來神经干细胞研究的迅猛发展使这一概念而临重人修正。现已证实，NSC不仅存在于胚胎神经系统，也存在于成年脑的某些特定部位，如海马、纹状体、室下核等处，干细胞及分化的最终产物表达不同的抗原标记，可以此监测细胞所处的分化状态。关于成年神经系统终干细胞的功能，现在还不十分的明确，一般认为，它们很可能与认知功能有关，室神经系统可蜩性的基础。具体的说就是在某些外界环境的影响下，干细胞在局部生成的新神经原可以参加记忆的形成和整合，即人脑控制行为，行为乂可以反过来影响犬脑的结构⑴。人

5、们对神经干细胞分离培养的成功，为神经系统的损伤修复和退行性病变的治疗带来了新的希望。1=1前对神经干细胞的研究已经形成了两个方向：一•是神经干细胞增值分化以后将其移植，二是借助于投入细胞因子等方法将体内的神经干细胞激活，分化形成神经元或胶质细胞，但由于外科手术和研究条件的限制,尤其是人们对于人神经干细胞生物学特性知之其少，因此神经干细胞的研究主要转向体外实验，用分离扩增的神经干细胞或将其分化之后进行移植，但这些干细胞是否与其在体内坏境时具有同样的能力，口前还所知其少。只有获得高纯度的神经干细胞并使其永生化将是今厉研究的难点。2神经干细胞的分离培养一直没有特定的程序

6、运用于原代培养分离神经干细胞,日前主要依赖于神经干细胞对存在于无血淸培养液中的丝裂原的感应能力來扩增，而其它的原代细胞在这种培养液中不易存活。基于这一特点，1992年Rreynolds和Weiss在EGF存在的条件卜，利用Neurosphere法从成鼠纹状体成功分离得到了神经干细胞。此厉，研究者纷纷利用该法成功地在体外分离、提纯、扩增神经干细胞，并在此基础上进行了改进。2.1有限稀释法分离神经T细胞这是目前多数实验室所采用的方法。在活体动物屮枢神经系统内己被确定有神经T•细胞的部位切取部分组织，机械或消化后分离成单细胞悬液(2X108・L・1),在含有高浓度有丝分

7、昆明医学院裂原(EGF和bFGF)的无血淸培养基屮孵育淇中一部分细胞增殖形成球形细胞团即Neurosphere,S些细胞团呈Nestin(神经干细胞特异蛋片•巢蛋片)阳性,具有分化为屮枢神经系统的3种主要细胞，即神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的潜能。7d后经机械分离使细胞球再次分离成为单细胞，细胞计数，-•般以1X107・L・1细胞数接种在24孔培养板屮,7d片再次分离细胞球，以1〜2个细胞/u1接种在96孔培养板屮，倒置相差显微镜下观察并标记含有单个活细胞的孔,7d后标记所有含细胞球的孔,搜集细胞球再次将细胞球分离成单细胞,接种于24孔板中，如此反复传代，可

8、获得较高纯