成体神经干细胞分化及自我更新的调控机制

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1、成体神经干细胞分化及自我更新的调控机制研究小组成员：陈静雯、蒋显、林珑、欧阳川、王朝、杨怡指导教师：袭荣文博士介绍已有证据表明，成体哺乳动物大脑中的神经发生贯穿整个生命周期。神经干细胞的分化及自我更新是这一过程的基础并对神经组织的修复和维持起着重要作用。许多神经退行性疾病也与其功能的失调相关。深入研究成体神经干细胞最终将有助于确立干细胞治疗的方案。我们组的研究兴趣在于探索影响成体神经干细胞分化或自我更新的分子，尤其是希望能找出一条起较为关键作用的调控通路。为此，我们选用繁殖周期短，基因组序列已知，干细胞研究相

2、对清楚的果蝇作为实验动物，通过大规模人工诱变，筛选出与成体神经干细胞分化调控相关的候选基因，最终通过酵母双杂交，基因沉默（或过量表达）观察相关蛋白表达量变化等方法推测出并验证其中起主导性作用的信号通路。小组活动7月17日选择成体神经干细胞作为研究对象，确定小组成员。组员初步讨论了各自对成体神经干细胞的研究兴趣，交流了对其相关背景的了解。讨论后发现虽然大家都对成体神经干细胞有感性的认识，但这方面的背景知识都比较欠缺，不清楚目前围绕这一课题的研究方向以及研究进展，不能具化出一个研究课题，决定先阅读相关文献以尽快弥

3、补对成体神经干细胞研究领域及现状的认识不足。7月19日PM9：00组员交流了各自查阅文献后新增加的认识以及心得，经过讨论，初步将研究课题定为成体神经干细胞的自我更新，并设立公共邮箱，将文献发到公邮中，以方便组员阅读。7月27日PM9:00最终确定小组的课题为成体神经干细胞分化及自我更新的调控机制。讨论过程中提出了两种实验方向：一是以一种或几种参与调控的特异性蛋白为导向，研究其对成体神经干细胞的影响，二是以调控通路为导向，即通过追踪成体神经干细胞不同时期蛋白表达的动态变化，找到可能参与调控的候选基因，通过基因沉

4、默或过量表达等方法，设法找到它们之间的相互关系，推测并最终验证出一条信号通路。经过讨论决定采用第二种方案，因为相对于前者，后者更加系统全面（当然工作量也更大）。7月28日PM:3:00邀请指导老师---袭荣文老师与小组成员座谈。袭老师启发式的提问以及耐心的讲解帮助大家建立起了一个更加清晰明确的实验思路，同时也使大家注意到了一些实际操作中的关键问题，比如如何建立一个实验系统，选择哪种实验动物，怎样鉴定并监测成体神经干细胞的动态变化等等，而这些具体问题是大家之前都没有细致考虑过的。与老师座谈结束后，小组成员又就老

5、师提出的有关实验操作的问题进行了讨论，最后由欧阳川负责整理实验的整体流程。实验思路1.通过对不同时期神经干细胞的蛋白质组分析，找到特异性最高，表达最稳定的蛋白作为标记靶分子，与GFP融合，建立分子标记。2利用GFP，通过FACS筛选出可用于实验的细胞，分离，鉴定，体外培养。3.选择果蝇作为实验动物，进行大规模人工诱变，筛选出具有与中枢神经修复，维持有关的突变表型的个体，通过染色体核型分析和基因测序找出突变基因，建立一个参与调控神经干细胞活动的候选基因库。4通过查阅相关文献报道，推测可能存在于同一条调控通路中的

6、基因，并对其相互作用做出猜想和假设5.通过局部两两检测，检验推测，具体方法包括：a.免疫共沉淀试验b.酵母双杂交c.基因沉默或转染瞬时高表达后对相关基因进行实时定量PCR，对相关蛋白进行westernblotting检测其表达变化.6.得出一个信号通路的草图，从全局层面进行进一步的实验验证。有待解决的问题：1.界定神经干细胞的存在成体神经干细胞的干细胞特性---自我更新以及具有分化成多种神经细胞的潜能---在体外是通过神经球和贴壁单层细胞培养实验证明的，但是目前还没有实验能够清楚地证明在体内进行的自我更新和分

7、化。因此需要设计出直接的工具来更有力地界定神经干细胞的存在。2.找到神经干细胞特异性的分子标记目前用于追踪细胞世系的标记包括Nestin,GFAP,Sox2等，但这些分子标记都表达在异质的细胞群中，而且并不清楚表达这些分子标记的细胞是否就是神经干细胞。1.找出影响神经干细胞分化的微环境（niche）中的功能性分子神经干细胞处于一个十分复杂的神经元调控网络中，其所处微环境中任何一种自分泌或旁分泌的分子都有可能影响其分化或自我更新。除此之外，，微环境外许多不同区域的神经元也有可能通过神经通路间接地对神经干细胞产生

8、影响。这种复杂性为精确地找出神经干细胞活动的影响因子，以及随后推测出信号通路增加了难度。感想成体神经干细胞对我来说是一个全新的领域。以前对神经干细胞只是有一个感性的认识，想当然地认为既然在大脑中它可以分化成各种类型的神经细胞，那么假如把正常的神经干细胞移植入患有退行性神经疾病（比如帕金森综合征，老年性痴呆症）的患者脑内就自然能修复有损伤的组织。但是当真正把它作为课题开始稍微深入一些的研究的时候才发现