胎鼠中脑腹侧与额叶皮质神经干细胞生物特性差异的比较

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1、胎鼠中脑腹侧与额叶皮质神经干细胞生物特性差异的比较作者：刘兵,欧微,彭超华单位：长江大学医学院，湖北荆州；长江大学附属第一医院荆州市第一人民医院内科，湖北荆州；武汉工业学院医学院，湖北武汉【摘要】目的：比较昆明小鼠胚胎中脑腹侧与额叶皮质来源的神经干细胞生物特性的差异，为更好的研究和利用神经干细胞奠定基础。方法：无菌条件下分离胚鼠中脑腹侧组织与额叶皮质，经消化及机械吹打成单细胞后接种于含有B27、bFGF的DMEM/F12培养基，培养扩增;倒置显微镜观察比较生长状况;机械方法传代;10%血清接种分化;免疫细胞化学方法染色鉴定神经干细胞及其子代细胞的分化方向，并作比较。结果：小鼠胚胎中脑腹侧

2、与额叶皮质均存在神经干细胞，其免疫细胞化学鉴定均呈Nestin阳性;但额叶皮质所含神经干细胞明显多于中脑腹侧，也更宜成球;结论：同样条件下，额叶皮质神经干细胞比中脑腹侧神经干细胞更易培养与增殖，但分化较晚。【关键词】神经干细胞;分离;培养;差异神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)是一种具有自我更新及多向分化潜能的细胞。它处于分化的非终末状态，可通过对称或不对称分裂出新的干细胞或分化潜能逐渐变小的子细胞，最终产生中枢神经系统的三种主要细胞，即神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。NSCs存在于胚胎和成年哺乳动物中枢神经系统的若干区域。在成年哺乳动物和晚期胚胎中，NSCs

3、存在的部位和数量都较少，而在早期胚胎中枢神经系统中NSCs则广泛存在。但进年研究同时表明，不同脑区来源的NSC特性并不完全相同，即NSC的“区域差异性”(regionaldifferentions)[1]。胎脑皮质是NSC的常用取材区;腹侧中脑是多巴胺能神经元的发源地,已被有些实验室证实存在神经干细胞[2，3]。为在体外得到足够数量的DA能神经元以提供PD细胞移植供体，本研究分别从昆明胎鼠大脑中脑腹侧和皮质分离出神经干细胞，旨在比较以上两个区域来源的NSCs在分离培养方面的差异，深入了解神经干细胞的生物学特性，为进一步探讨小鼠胚胎NSC移植的临床研究奠定基础。　　

4、1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1实验动物孕11～15d昆明小鼠(E11E15dSPF级)由武汉大学实验动物中心提供。　　1.1.2试剂DMEM/F12培养基，特优级胎牛血清(FBS),B27均购自GIBCO公司(USA);碱性成纤维生长因子(bFGF)购自Peprotech公司(USA);胰酶(Trypsin)、DNA酶1(DNase1)、左旋多聚赖氨酸(PLL)和DAPI购自SIGMA公司(USA)。抗体：羊抗鼠antinestin单克隆一抗及相应的荧光标记二抗;小鼠抗大鼠antiTH单克隆一抗以及相应的荧光标记二抗均购自美国AlphaDiagnosticIntl.Inc

5、公司;其余试剂均为市购。　　1.2方法两种NSCs的分离、原代培养、传代培养、分化和免疫细胞化学鉴定见文献[4，5]。　　2结果　　2.1中脑NSC的原代及传代培养细胞孕12～13d的胚鼠中脑腹侧组织以5×105/ml单细胞悬液接种时，中脑神经干细胞经台盼兰染色示细胞胞体较小，24h后可见大量细胞呈碎渣样死亡，死亡细胞几乎达到一半，存活细胞沉底、圆形、晶亮，未见突起，同时皿底也可见散在分布的突起状细胞。36h后细胞形成2～5个细胞的聚集体，还可见许多漂浮的碎片样聚集物(见第90页彩色图版Ⅲ之图1)，4d时聚集体增大形成几十个细胞的神经球，细胞之间界限不很清楚，球状团块周围有光

6、晕，呈悬浮状态，此为典型的神经干细胞球。6d时神经球直径约10～15μm(×100)，分布约50～80个/cm2，活力较好。培养至7天时，球体较大，神经球直径可达15～20μm(×100)(见第90页彩色图版Ⅲ之图2)。在7～10d的培养期间，可见部分原先悬浮的神经球贴附于未包被任何基质的皿底，并伸出细长丝状联系与短的突起，其余神经球仍呈悬浮生长，这一现象随培养时间的延长而增多。中脑NSCs传代培养生长性状基本同原代，经机械吹打传代后死亡细胞较多，部分单细胞2d后出现分裂相，随后逐渐形成神经球，生长速度基本同原代。　　2.2皮质NSC的原代及传代培养细

7、胞接种早期的额叶皮质干细胞胞体较中脑的略大，圆形，未见突起，光镜下折光性好，晶亮;24h可见大部分细胞沉底，无突起，细胞间有少量死亡细胞呈碎渣样;36h可见沉底的细胞形成5～10个细胞的聚集体(见第90页彩色图版Ⅲ之图3);2d可见聚集体增大，悬浮，形成十几个细胞的神经球(neurosphere),以后细胞球继续增大，5～7d细胞球直径可达20～25μm(×100)，此时神经球分布约50～100个/cm2，球体均匀