成体小鼠肠神经嵴干细胞体外分离、培养及鉴定

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1、成体小鼠肠神经嵴干细胞体外分离、培养及鉴定【摘要】　　目的：利用简化无血清培养基和连续传代法，从成体小鼠肠管分离培养肠神经嵴干细胞(GNCSCs)，观察细胞体外培养过程中增殖、分化的特点.用p75,GFAP,Peripherin,αActin作为特异性标志来鉴定GNCSCs及其分化的细胞系.方法：将新生1，5d的小鼠肠管制成单细胞悬液，接种于无血清DMEM/F12完全培养基中贴壁培养，连续传代培养并观察克隆球的形成过程.将克隆球接种于含血清的DMEM/F12完全培养基中，观察其分化现象.用免疫细胞化学和免疫荧光法检测克隆球及其分化细胞系特异性标志物的表达.结果：成体小鼠肠管中有少

2、数细胞在无血清培养基中存活且增殖形成克隆球.免疫染色表明克隆球是GNCSCs并且在血清诱导下可分化为神经元、神经胶质细胞、平滑肌细胞.结论：成体肠管中存在具有自我更新和多向分化能力的GNCSCs，在体外GNCSCs可分化为肠神经系统所必须的细胞类型.【关键词】肠神经嵴干细胞小鼠细胞培养技术细胞分化Hirschsprung病0引言应用神经干细胞治疗某些神经系统的损伤和退行性疾病，经过较长时间的实践已被证明是行之有效的［1］.肠神经嵴干细胞（gutneuralcreststemcells,GNCSCs）起源于神经管背侧，具有干细胞特性［2］，将其用于治疗先天性巨结肠症及肠神经系统干细胞

3、疾病的研究已引起人们的关注,本实验着重进行GNCSCs的基础研究，为临床应用建立理论基础.1材料和方法1.1材料新生1，5d昆明小白鼠，15只，体质量不拘，西安交通大学医学实验动物中心提供.①DMEM/F12完全培养基（Gibco）组成：B27添加剂（Gibco），N2添加剂（Gibco），重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,vitrogen),β巯基乙醇（Sigma），青霉素和链霉素（华北制药）.②促分化培养基组成：DMEM/F12完全培养基除bFGF外再添加100mL/L肽牛血清.③其他：胰蛋白酶、Ⅳ胶原酶（Sigma），左旋多聚赖氨酸（Sigma）.一抗：兔抗小鼠NGF

4、Rp75（武汉博士德）、兔抗Peripherin多克隆抗体(Chemicon)，兔抗GFAP多克隆抗体（DAKO），鼠抗小鼠αActin单克隆抗体（Sigma）SABC试剂盒、DAB显色试剂盒（博士得生物工程有限公司）.二抗为TRITC标记山羊抗小鼠IgG(北京中杉).1.2方法1.2.1取材、克隆球的培养颈椎脱臼法处死2组小鼠，将其肠管放入Hanks，清洗，机械分散肠管组织，胰蛋白酶和Ⅳ胶原酶分别消化肠管组织30min，10min，终止消化后反复吹打制成单细胞悬液，用200目，400目的滤网过滤，以800r/min离心5min，弃上清，用预先配置的无血清完全培养基重悬细胞，台

5、盼蓝染色计数活细胞，以6×108个/L接种到25mL培养瓶中，添加培养基至4mL.在37℃,50mL/LCO2,饱和湿度培养箱中水平放置，贴壁培养.原代孵育24h后弃去漂浮的死细胞，以2/3量换液，孵育3d后进行传代，以6×108个/L接种到25mL培养瓶中，继续孵育40~48h后再次传代，如有细胞团块形成则以1代/1~2d的速度传代，3代之后可形成圆形的克隆球.1.2.2克隆球的分化用含100mL/L胎牛血清的完全培养基重悬传代5次后的克隆球，接种于放置有预先包被左旋多聚赖氨酸盖玻片的35mm培养皿内，每皿2mL，动态观察克隆球的分化情况.1.2.3克隆球及其分化细胞特异性标志物

6、的染色应用p75NTR,GFAP,Peripherin，αActin抗体分别检测克隆球及其分化细胞系的性质，封片后分别用光学显微镜和激光共焦显微镜取图.2结果2.1克隆球的生长状况接种初期，倒置显微镜下观察到单细胞和一些呈半球状或不规则的细胞团.孵育24h后，贴壁细胞胞呈圆形，胞体小,折光性好，部分贴壁细胞胞体增大,折光性增强,出现分裂相，形成2～5个细胞的细胞团，另一部分呈聚集生长.3d后形成十几或数十个细胞构成的克隆球(图1A)，克隆球增大的同时向周围伸出放射状的细胞索，形成较小的次级克隆，这些克隆球形态完整，折光性减弱，周边界线清晰，但其中心密集，界限不清，无法观察到完整的

7、细胞结构（图1B）.重新传代培养，可观察到细胞胞体增大，出现分裂相的克隆球数量逐渐增多，杂质细胞减少，在连续传代过程中克隆球逐渐纯化.2.2克隆球的分化接种含血清培养基12h后，可见有细胞从克隆球中迁出，迁出的细胞贴壁生长；24h后克隆球变扁，迁移出的细胞增多，相差显微镜下难以分别形态；48h后贴壁细胞数量明显增加，逐渐形成单细胞层且细胞形态多元化.2.3克隆球及其分化细胞系的免疫染色免疫细胞化学方法进行p75,Peripherin,GFAP,αActin免疫染色（