小型猪成体心肌干细胞的体外培养及鉴定

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1、分类号：R541.4学校代码：10062密级：学号：2012602428硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：小型猪成体心肌干细胞的体外培养及鉴定TITLE:InVitroCultureandIdentificationofCardiacStemCellsfromAdultMini-pigs一级学科：临床医学二级学科：内科学心血管病论文作者：李彬指导教师：卢成志教授天津医科大学研究生院二〇一五年五月分类号：R541.4学校代码：10062密级：学号：2012602428学位类别：科学学位专业学位□√学科门类：医学硕士学位论文MASTER’

2、SDISSERTATION论文题目：小型猪成体心肌干细胞的体外培养及鉴定TITLE:InVitroCultureandIdentificationofCardiacStemCellsfromAdultMini-pigs一级学科：临床医学二级学科：内科学心血管病论文作者：李彬指导教师：卢成志教授导师组成员：陈欣夏大胜天津医科大学研究生院二〇一五年五月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对

3、本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密□√。学位论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日天津医科大学硕士学位论文中文摘要目的：心肌干细胞再生疗法是心肌梗死的新型治疗方法，但是心肌干细胞数量少，扩增难度大

4、，其体外培养方法并没有统一的标准，国内许多实验室获得的心肌干细胞未能实现其多向分化潜能的鉴定，从而尚不能作为心肌干细胞的有力佐证。本研究旨在探讨一种高效、稳定的小型猪心肌干细胞体外培养方法，并且对其进行全面系统的鉴定，为心肌梗死的细胞生物疗法奠定基础。方法：选取成年巴马小型猪，雌性，体重25-30kg。通过心脏外科手术经右侧第二肋间做小切口钳取右心耳组织，用组织块培养法获取原代心肌干细胞，以心肌干细胞培养液进行培养，视细胞生长情况进行传代。选取分选纯化后的第3代细胞行流式检测鉴定细胞表型：c-kit、CD34、CD45、CD31、CD90、Lineage；行Wes

5、ternBlot检测心肌早期特异性转录因子Nkx2.5和GATA-4的表达；经诱导剂诱导后行免疫荧光检测CX43、cTnT、α-SMA、vWF的表达以观察心肌干细胞的多向分化潜能。结果：1.从成年小型猪右心耳组织中分离的原代细胞于倒置显微镜下观察呈“小、圆、亮”的特征，生长缓慢，传代后细胞贴壁生长，形态逐渐变成梭形，较原代易于生长。2.纯化后细胞经流式细胞仪鉴定细胞表型为c-kit+CD34-CD45-CD31-CD90-Lineage-。3.WesternBlot检测结果示心肌早期特异性转录因子Nkx2.5和GATA-4表达阳性。4.纯化后细胞经不同诱导剂诱导培

6、养后，能够表达：心肌细胞特异性蛋白CX43和cTnT，平滑肌细胞特异性蛋白α-SMA，以及内皮细胞特异性蛋白vWF。结论：1.自成年小型猪右心耳组织成功分离获得细胞表型为c-kit+CD34-CD45-CD31-CD90-Lineage-的细胞，阳性表达干细胞表面标记物。I天津医科大学硕士学位论文2.本研究获得的细胞能够表达心肌早期特异性转录因子Nkx2.5和GATA-4，提示该细胞具备调控自身向心肌细胞早期分化的能力。3.经诱导剂诱导培养后细胞能够表达CX43、cTnT、α-SMA、vWF等特异性标记蛋白，提示该细胞具有向心肌细胞、平滑肌细胞及内皮细胞等多方向分

7、化的潜能。4.本研究自原代组织块中分离、培养、纯化所得细胞经流式细胞仪、WesternBlot测定、多向分化潜能检验等过程鉴定为心肌干细胞。本研究探索出一种高效、统一的小型猪心肌干细胞体外培养及鉴定方法，对于临床治疗具有指导意义。关键词：心肌干细胞细胞培养细胞扩增流式细胞仪分化II天津医科大学硕士学位论文AbstractObjectives:Cardiacstemcellregenerativetherapyisanewtreatmentofmyocardialinfarction.However,thereisnouniforminvitroculturesta

8、ndard