小鼠心肌干细胞的体外分离培养、分选与鉴定及他汀对心肌干细胞存活的研究

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1、学校代码：10023学号：200501011小鼠心肌干细胞的体外分离培养、分选与鉴定及他汀对心肌干细胞存活的研究Isolation，culture，sortingandidentificationofc-kitpositivecardiacprogenitorcellsfromadultmousehearttissueinvitroandtheeffectofatorvastatinoncardiacprogenitorcells专业年级：北京协和医学院临床医学专业05级姓名：张昊导师：杨跃进(

2、教授)阜外心血管病医院心血管病内科完成日期：2013年6月mY0042㈣38㈣09洲1㈣8帅目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3第1章文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．1摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．51．2前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．3为何选择心脏干细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、．51．4心脏干细胞的存在和数量⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．61．5不同种类的心肌干细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．71．6提高干细胞的移植率和驻留率⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．101．7未来的发展方向⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．12第2章c．kit阳性细胞的体外分离培养、分选和鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯”142．1前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。142．2材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．142

4、．3结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯202．4讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯27第3章他汀对心肌干细胞在缺氧／无血清状态下存活的初步研究⋯⋯⋯⋯⋯323．1前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．323．2材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。323．3结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯343．4讨{仑⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

5、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．39后记与致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．53学位论文原创性声明和授权使用说明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．54中文摘要，r量：研究表明心脏存在干细胞，具有自我更新和多向分化的能力。2011年及2012年国外已开展心肌干细胞用于急性心肌梗死及缺血性心肌病的临床试验，其中SCIPIO利用c．kit阳性心肌干细胞治疗心衰，EF显著提高；而CADU

6、CEUS实验利用小球(cardiosphere)治疗急性心梗，局部心肌活力改善，但左室射血分数无显著性差异。最新的动物实验表明心肌干细胞用于治疗急性心肌梗死效果优于骨髓单个核细胞和骨髓间充质干细胞。然而，心肌干细胞的提取、分离、扩增过程周期长，较其他细胞更为复杂。建立成熟的细胞培养方法成为以后基础研究和临床试验的前提条件。同时，既往的研究表明，单纯输注干细胞治疗心梗后心衰效果有限，这是因为细胞驻留率不高及心肌梗死后恶劣的微环境所致。因此，提高干细胞本身的活力及改善移植后干细胞生长的微环境策略是近

7、年研究的热点。置帕：1)建立从成年小鼠心脏组织中分离培养得到c．kit阳性心肌干细胞的有效方法；2)探索阿托伐他汀对心肌干细胞在缺氧／无血清培养下的作用。方羞：1)心肌干细胞的分离培养和扩增：无菌条件下取2月龄成年C57BL／6小鼠心脏，PBS洗涤，剪碎，经胰蛋白酶和胶原酶Iv消化后，置于Matrigel组织块培养基(completeexplantmedium．CEM)中培养。大约2周后，收集心肌组织旁爬出成纤维状细胞板层上的小、圆、亮的细胞，接种于多聚赖氨酸包被的培养皿中，予以心球生长培养基(

8、cardiosphere．growingmedium，CGM)继续培养，传代扩增后再通过磁珠分选收集纯化的c．kit阳性心肌干细胞。分选前及分选后用流式细胞仪分析所得细胞其表面抗体c．kit和sca．1的表达。2)他汀对缺氧／无血清心肌干细胞的作用：分选后的心肌干细胞置于含不同浓度他汀(对照组，10。3IJmol／I，10。2IJmol／I，10。1Umol／I，1IJmol／I，lOpmol／I)的无血清心球生长培养基中，在缺氧12小时后观察细胞形态的变化，用流式细胞法分析细胞凋亡比例。簟■：