人表皮干细胞的体外分离培养和鉴定

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1、人表皮干细胞的体外分离培养和鉴定人表皮干细胞的体外分离培养和鉴定［摘要］目的：探讨人表皮干细胞的体外快速分离培养及鉴定方法。方法：中性蛋白酶和胰蛋白酶两步法从手术切除的人包皮组织中分离表皮层和真皮层，并获得表皮单细胞悬液，采用IV型胶原铺板选择性粘附、分离和角质形成细胞无血清培养基(K-SFM)培养表皮干细胞。倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况，检测细胞克隆形成率，免疫组化染色观察表皮干细胞标志物B1整合素和角蛋白19(K19)的表达；以角质形成细胞作为对照。结果：组织学观察显示，培养24h后细胞呈克隆状生长;所分离、培养细胞的克隆形成率高于对照角质形成细胞组;免疫组化染色显示，培养细

2、胞B1整合素及K19均呈阳性表达。结论：运用IV型胶原粘附结合K-SFM培养可以实现人表皮干细胞的体外快速分离和培养。［关键词］表皮干细胞；细胞培养；细胞分离；鉴定［中图分类号JQ813.1［文献标识码］A［文章编号11008-6455(2007)10-1343-03Isolation‘cultureandidentificationofhmnanepithelialstemcellsLIDan,LIShi~rong,CAOChuan(DepartmentofCosmeticSurgery,SouthwestHospital,theThirdMilitaryMedicalUnivers

3、ity,Chongqing400038,China)Abstract:0bjectiveToexploreamethodforisolationandcultureofhumanepidermalstemcells・MethodsTheEpidermalstemcellwereisolatedbyadheringtocollagentypeIVafterobtainedbydigestinghumanforeskinwithDispaseIIandTrypandcultureinvitroinK~SFM.TheexpressionsofB1-integrinandkeratin19(K

4、19)inepidermalstemcellweredetectedwithimmunocytochemicalmethods,andthecolonyformingefficiencywasalsostudied・Keratinocyteswereservedalsodetected・ResultsItwasrevealedbyhistologicalobservationthatcolonieswereformed24hoursafterinoculation.Theisolatedandculturedcellcloningefficiencywashigherthanthato

5、fthecontrolgroup・PositiveexpressionofB1-integrinandK19ofculturedcellswasdetectedbyiminunocytochemistry.ConclusionAdultepidermalstemcellscouldbesuccessfullyisolatedandculturedbyadhensionwithtypeIVcollagenandculturewithK-SFMKeywords：epidermalstemcells;cellculture;cellisolation;identification皮肤作为人体

6、最大的器官，外层的表皮终身不断自我更新。这种更新由表皮基底层具有再生能力的角质形成细胞分裂、增殖、分化来完成。皮肤角质形成细胞主要包括表皮干细胞(epidermalstemcell,ESC)>短暂扩增细胞(transitAmplifyingcell,TAcell)及终末分化细胞(postmitoticdifferentiatingcell,PMDcell)[2]o其中，位于基底部的表皮干细胞持续增殖分化以取代外层终末分化细胞。从而在维持组织结构的更新、细胞内环境的稳定和创伤后创面修复过程中起着至关重要的作用，但由于ESC数量较少(只占基底细胞总数的1%〜10%[1]),缺乏明确的特异性

7、分了标志，体外培养很容易丢失其干细胞生物学特性，因而如何大量获得纯度较高的表皮干细胞即成为目前干细胞研究领域的热点。本研究利用酶消化法和IV胶原筛选贴壁对人包皮表皮干细胞进行分离和纯化，以期为进一步研究奠定基础。1材料和方法1.1角质细胞无血清培养基(SFM-KC)(美国Gibco公司)，Dispease酶(美国Gibco公司)，人胎盘IV型胶原(美国Sigma公司），胰蛋口酶、小鼠抗人角蛋口19、小鼠抗人B1整合素，PowerVisionTM