资源描述：
《人表皮干细胞的分离培养.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、人表皮干细胞的分离培养【摘要】目的探索人表皮干细胞原代培养方法。方法将皮狀标本进行分离，用Dispasell酶消化表皮皮片示，重悬细胞，接种于铺有IV型胶原的培养瓶进行培养。表皮干细胞的鉴定采用免疫细胞化学技术检测其表面标记物01整合索、CK19的表达。对表皮干细胞与角质形成细胞的克隆形成情况进行比较。结果倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长状况良好，表皮干细胞B1整合素及CK19角蛋白染色阳性。表皮干细胞克隆形成率高于角质形成细胞（卩〈0.05）。结论采用木方法进行人表皮干细胞的培养较为理想。【关键词】表皮干细胞；培养；鉴定Isolationandculturemetho
2、dsofhumanepidermalstemcellsTianYa-ni.ng,ZhouZhihui,LiangMan,etal•SecondAffiliatedHospitalofShanxiUniversityoftraditionalChinesemedicine,Xianyang712000,China【Abstract]ObjectiveThepresentresearchwasperformedtofindprimarycellculturemethodofhumanepidermalstemcells.MethodsTheskinsampleswereiso
3、latedbyDispaseII,thecel1swereseededincultureflaskwhichwasdealedwithtypeIVcollagen.Theepidermalstemcellswereidentifiedbyiminunocytochemicaltechniqueforthedetect!onofintegrinB1andCK19.Thecellcloneformationofepidermalstemcellsandkeratinocytewerecompared.ResultsCellmorphologywasobservedunderm
4、icroscopeandgoodgrowthstatusinverted,epidermalstemcellswerepositivereactiontointegrinB1andCK19antibody.Epidermalstemcel1cloneformationrateishigherthanthatofkeratinocytes（P〈0.05）.ConclusionOurresultsindicatethatthemethodwaseffectiveforculturehumanepidermalstemcells・[Keywords]Epidermalstemc
5、ell；Culture；Identification表皮干细胞具有无限增殖的能力，在组织工程皮肤的研究中具有重要的作用，本文就表皮干细胞的原代培养进行探讨。1材料与方法1.1主要试剂DMEM培养基（dulbecco'smodifiedeaglemedium,DMEM）,单克隆抗体Bl整合素，单克隆抗体CK19,IV型胶原，DispaseII酶，胎牛血清（FBS）,表皮细胞生长因子，0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）o1.2实验设备C02恒温培养箱，无菌超净工作台，倒置相差显微镜，普通光学显微镜。1.3方法1.3.1原代培养严格无菌操作，切取5X5mm2左右的皮肤标
6、本,标本源自本院4月龄自愿引产胎儿包皮，切取前分离皮下组织，将分离得到的皮肤组织用含青-链霉索的PBS冲洗3次，切成小皮块后置于含2.5mg/inlDispaseIT酶的DMEM培养基中4°C过夜，培养基中含有青霉素（100U/inl）及链霉索（100Ug/ml）,第二天分离表皮和真皮层，收集表皮皮片，37°C条件下0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化15min,胎牛血清终止消化，轻轻吹打，2000筛网过滤，收集细胞悬液，1000rpm离心5min,弃上清，加入新鲜培养液（DMEM表皮干细胞完全培养液含10%的FBS,10Mg/L的表皮细胞生长因子，L-谷氨酰胺
7、0.1mM,非必需氨基酸0.1mM）,重悬细胞，计数，调整细胞浓度至5X105个/ml,种植于铺有IV型胶原的培养瓶进行培养（37°C,5%C02饱和湿度悄温培养箱），培养瓶及培养板等均用IV型胶原预先铺好，并用加有双抗的DMEM培养液轻轻清洗1次。每3天换1次液，并在倒置显微镜下观察细胞生长状况及有无其他病原体污染，对于未贴壁的细胞轻轻吸出作为角质细胞对照组加入相同的培养液进行培养。1.3.2传代培养细胞长至80%融合以后，经0.25%胰蛋白酚消化5min左右，终止消化，用吸管轻轻吹打贴壁细胞，收集细胞悬液，1000rpm离
