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1、人胎儿毛囊隆突细胞的分离、培养与鉴定【关键词】隆突细胞Isolation,cultivationandidentificationofhumanfetalfollicularbulgecellsinvitroWANGHongTao,CHENBi,TIANRong,TANGChaoWu,TAOKeDepartmentofBurnSurgery,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xian710033,China,DepartmentofDermatology,Ai
2、rForceGeneralHospital,Beijing100036,China[Abstract]AIM:Todeveloparapidandreproduciblemethodforthecultureofpurefollicularbulgecells.METHODS:5-7monthfetalfollicularbulgewasisolatedandincubatedincollagenaseIfor6-8h,andbulgecellswerepurifiedusingtrypsin,identifiedus
3、ingimmunocytochemicalmethods;flowcytometryandMTTassaywereappliedtomeasuretheclonerateandcellcycle.RESULTS:About100follicularbulgeswereobtainedeachhour,andthebulgecellswerepurifiedbytrypsin.ThecellpercentageinphaseGIwas88.20%,thecloneformationratewas18.2%andtheK1
4、9positivecellscouldbedetected.CONCLUSION:Arapidandreproduciblemethodhasbeendevelopedforthecultureofpurefollicularbulgecellswhichrepresentmanycharactersofsomestemcells.[Keywords]follicularbulgecell;cellculture;stemcell;follicle【摘要】目的：建立一种简单高效的毛囊隆突细胞的培养方法.方法：将5〜7m
5、o终止奸娠胎儿头皮的毛干中上部剪卜后I型胶原酶消化，采川成纤维细胞和毛囊隆突细胞对胰酶的不同敏感性进行纯化，流式细胞仪进行细胞周期分析，MTT法检测细胞克隆率，免疫组化检测细胞K19的表达情况.结果：消化法原代培养可以每小时获得100个左右毛囊隆突，经姨酶消化不同吋I'可可以纯化毛囊隆突细胞，流式细胞仪检测第二代细胞G1期占88.20%,细胞克隆形成率为1&2%,K19表达呈阳性.结论：建立了一种简单高效的毛囊隆突细胞的分离、培养方法，并证明其具有某些干细胞的特征性表现.【关键词】隆突细胞；细胞培养；干细胞；毛愛0引言
6、毛囊是一个结构和功能非常复杂的亚器官，能够依据静止期、生长期和退化期周而复始.毛囊屮存在具佇多项分化潜能的毛囊干细胞，而Lavker等[1]通过慢扩增细胞定位证明毛囊干细胞主要位于毛囊降突(bulge)部，所以对于毛囊降突部细胞的体外分离培养和研究有助于对毛囊干细胞的进一步研究.1材料和方法L1材料标本为西京医院5〜7mo胎龄终止妊娠人流胎儿头皮(家属知情同意).主要试剂有DMEM/F12培养基(Hyclone),无血清角质细胞专用培养基(GIBCO),脐带血清(自制)，2.5g/Ldispase(Sigma),2.5
7、g/LI型胶原酶(Sigma),1.25g/L胰蛋白酶(Sigma),10ug/LEGF(Sigma),100力「U/L青縛素,100mg/L链零素，抗角蛋白19(KI9)mAb(ADI).1.2方法1.2.1毛囊隆突细胞培养棊配制不含添加剂的无血清角质形成细胞培养基(KFSM)加入50mL/L脐带血清,EGF10Ug/L,bFGF4ug/L,霍乱毒素20Ug/L,L谷氨酰胺0.1mmol/L,非必需氨基酸().1nimol/L.1.2.2毛囊隆突细胞的原代培养剪去头皮外毛发及皮下组织屮脂肪和结缔组织，将头皮剪成细条状
8、，置于0.5g/L的洗必泰溶液中浸泡10min,无菌PBS洗涤2遍.轻轻剪除暴露的毛球部(用于另外毛乳头细胞的培养)，然后贴近表皮剪下真皮组织，得到毛干的中上段，加入2.5g/L的I型胶原酶中37°C消化6~8h,PBS洗涤2次，以含100mL/LFCS的DMEM/F12培养基重悬，放人25mL培养瓶屮，37°C,50mL/LCO
