资源描述：
《成熟心肌细胞的分离与培养方法.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、第四军医大学学报(JFourthMilMedUniv)2000;21(6)S153-12+·经验交流·文章编号:1000-2790(2000)06-S0153-01进行再循环.酶消化到最后,用100mol·LCa溶液洗5min,将酶溶液洗出.然后将心脏割离套管,割去心房和主动成熟心肌细胞的分离与培养方法脉.在灭菌的皮氏培养皿上,用小剪刀剪碎心室组织,将组织旋转在振摇烧瓶中,浸于50mL100mol·L-12+溶液中,Ca并在37℃下轻轻摇动以机械性分离心肌细胞.同时给被消化1231预防医学李予蓉,商立军,范风云(第四军
2、医大学:组织充氧,充氧亦应温和.振荡5～10min后,过滤心肌细胞.系放射医学教研室,2基础部生理学教研室,3西京医院放射治50g离心1min后,先用500mol·L-12+溶液置换上清Ca疗科,陕西西安710033)液,再用1mol·L-1Ca2+溶液置换.温和的离心过程丢弃了大多数非心肌细胞、死亡细胞或高度收缩的心肌细胞.有些关键词:成熟心肌细胞;分离;原代培养实验室发现,用40mL·L-1牛血清白蛋白离心或进行密度梯中图号:Q831.11文献标识码:B度离心,可进一步增加柱形心肌细胞的含量.最后,细胞在培养基中再次
3、悬浮并铺开[2].为了将心肌细胞以合适的密度铺0引言我们介绍一种在无血清培养基中分离和培养成熟开,可在4mol·L-1Ca2+溶液中用血细胞计数器对一小样本心肌细胞的方法[1,2],着重强调对优化心肌细胞培养至关重要进行计数.合适数目的细胞进行离心,而后在培养基的整个的分离过程.容积范围内再次悬浮,该培养基应足以覆盖培养物表面,心肌4-2细胞可以按10·cm柱形细胞的密度铺开.一旦心肌细胞1材料分离装置可用典型的Langandorff装置,配合无菌被铺开,则将其放置4h完成吸附.这段时间过后轻轻更换介操作要求,对心脏进行逆
4、行灌注.基本灌流液(溶液A),是用质,除去所有未吸附的细胞。培养的心肌细胞对切应力和介质纯水和高纯度试剂制备,其成分有(mmol·L-1):NaCl130;骚动很敏感,因此介质更换必须缓慢而小心.第1次介质更HEPES23;葡萄糖21;牛磺酸20;肌酸5;MgCl25;丙酮酸钠换后,每隔3d更换1次,介质需要预先用50ml·L-1的CO25;KCl4.5;NaH2PO41;pH7.3.过滤(0.2m滤纸片)溶液除加温和平衡.去微生物和水颗粒.A溶液是分离过程中使用的其他4种溶液的原料:750mol·L-12+溶液(3
5、00mLA溶液+750Ca3讨论培养成熟的心肌细胞难度较大,除了要求得到很-12+2+mol·LCa);游离Ca+EGTA溶液(300mLA溶好的急性分离的细胞外,还需要细胞培养的无菌环境.既往液+3.3mol·L-1EGTA);酶溶液(80mLA溶液+100研究表明,不同标本来源的心肌细胞以不同方式适应培养环-12+,1g·L-1天然胶原酶和0.1g·L-1蛋白mol·LCa境,其中有一些在培养基中会更快地发生形态学改变.鼠、豚-12+酶);!“酶洗脱”液(220mLA溶液+100mol·LCa).鼠、猫和兔是
6、心肌细胞培养的最普遍应用的标本,可根据每种常规用来培养成熟心脏细胞的基础的、非补充培养基是碳酸标本的冠脉灌流率和所摸索的最佳酶灌流次数,对溶液量进氢盐缓冲培养基199.一般补充成分有(mmol·L-1):肌酸5;行调整,用相似的方法分离各种动物的心肌细胞[1].分离出牛磺酸5;L-肉毒碱2;丙酮酸2.5;胰岛素0.1mol·L-1.为的心肌细胞数量是一个重要的因素.心肌细胞向培养基表面防止细菌感染,所有介质均含有青霉素50U和链霉素50mg的吸附会影响细胞形态[3].与培养基表面的相互作用可能会-1-1·L.细胞保存于恒
7、温箱无菌环境中,50mL·LCO2～改变其他特性,如膜电流和收缩性.应用最为广泛的吸附因950mL·L-1空气的气体环境中37℃.吸附底物预处理培养子是层粘连蛋白[1,2],Ⅳ型胶原对成熟心肌细胞吸附同样有基表面可使用塑料或玻璃.玻璃盖片在使用前用700mL·效,而Ⅰ型和Ⅲ型胶原作用较差.所有用于心肌细胞培养的L-1乙醇清洗,水冲洗并自动吸附.有人提出用硝酸蚀刻玻璃2+分离技术都是使用低Ca溶液去破坏细胞间连接,再通过酶以达到最佳吸附效果,但这不是必需的.层粘连蛋白最终要消化分解细胞外基质,最后机械搅动分离出单个细胞.因而
8、,-1在一定量磷酸盐缓冲盐水或培养基中稀释至15mg·L的酶的选用至关重要.我们介绍的方法既充分考虑到细胞培养浓度.这些盐水和培养基需足以覆盖培养物表面.层粘连蛋的特殊要求,又充分利用成熟心肌细胞的较为成熟的分离技白在铺开细胞前至少30min就会吸附到培养皿上.术,并使之结合,解决了成熟心肌细胞培养的技
