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时间:2018-10-29
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1、心肌细胞培养方法详述配液:Hanks液、低糖DMEM液、高糖DMEM液、胰酶消化液、双抗液、碳酸氢钠液、盐酸液。取鼠:鼠盆用棉铺好,取鼠。准备:事先检奔显微镜、磁力搅拌器及离心机是否好用,提前三小时把小牛血清、胰酶、抗生素拿出来化开。其余未冻药品也提前20分钟拿出来缓和一下。新洁尔灭(0.1%)泡纱布(用10ml5%的新洁尔灭加水至500ml即得),消毒地面(1:500的84液)。用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好,幵紫外线灯照30分钟后幵鼓风机吹至实验结束。物品:白大衣、饭盒小剪子、小镊子(4套)(一套剪皮肤、一套开胸取心,一套剔除心缘纤维组织,一套剪碎
2、心脏)瓶皿(2套)[两个小圆培养皿,培养皿内加DMEM液,先后装取出的心和剔出纤维组织后的心][一个小烧杯装碘酒和酒精棉球]250ml烧杯3个[一个用于水浴,事先加好水,最好是一或二蒸][一个装0.1%新洁尔灭150ml左右,消毒小鼠]500ml烧杯1个,用作废液缸。50ml烧杯3个(剪碎心肌组织,最后配液)三角烧杯(50ml)+小转子(小转子,酒精擦,双蒸水冲后,再把酒精彻底冲掉后用三角烧杯高压)离心管及帽(12-14个),两个试管吸管(5〜8个)大镊子(两把,持物,例夹棉球等)台面:磁力搅拌器、纱布(事先用于托盘装0.1%新洁尔灭浸泡)、试管架、泡沬
3、塑料板、五个针头(不用消毒)75%酒精棉球及碘酒(消毒棉球,泡酒精、碘酒)大镊子两把(一把夹棉球,一把取鼠)、3个250ml烧瓶(一个装一蒸水,一个装新洁尔灭,另一为空的备用)1个500ml烧瓶(废液缸)、温度计、PH试纸(事先调PH值)、洒精灯、打火机/火柴、载玻片(5-10个)
4、用于培养前看接种密度及消化后看细胞密度]、注射器5ml6个(胰酶、DMEM、小牛血清)1ml2个(双抗液)20ml备用2个、微量加样器1000ml及500ml以上物品均用紫外线照30分钟。另外准备手套、帽子、口罩、24孔培养板、离心机+—把小锁、未冻药品及DMEM、HCL、N
5、aHCO3、小牛血清。事先把显微镜、离心机、磁力搅拌器电源插好。检查酒精灯是否有酒精,碘酒和酒精棉球是否够用。先把物品递入,后穿大衣、帽子和口罩。然后把酒精灯打开,把瓶皿摆好,再用一个瓶皿装酒精棉球。培养过程,1.把两个5ml注射器分别插入DMEM和胰酶中,分别向两个圆皿中加入5ml的DMEM培养液。用一把大镊子从鼠盆里取出一只生后2〜3天的SD大鼠,放入0.1%新洁尔灭浸泡一下后拿出放在泡沫板上,用针头把鼠固定(位置摆正),用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤,再用酒精棉球脱碘,取一把小剪子及小镊子开皮,充分撕拉开,再用酒精棉球消毒,后换另一把小剪子和镊子在
6、剑突处正中线稍偏左开胸取心。2.取出的心放在刚才准备的一个装有DMEM的圆皿屮再取K一只。重复以上过程。(鼠全部杀死后,把取鼠镊及泡沫板、新洁尔灭缸等拿出台面。消毒、清洁,铺纱布、换手套。1.用第三副剪子和镊子把圆皿中的心脏周边的血凝及纤维组织剔除掉,放在另一个预先装好DMEM的圆皿屮。抽取5ml的胰酶,然后将其屮少许放入50ml的小烧杯中,大部分倒入三角烧瓶中。用第四副剪子将烧杯中的心脏剪成lmm3的碎块,倒入三角烧瓶中(可用剪刀刮入),再用剩余胰酶刷净烧杯。2.把温度计和三角烧杯放入250ml烧瓶中,(事先调好水量,多会没过三角烧杯,少温度会不均匀)
7、。打开磁力搅拌器电源,调温度(使-缓慢加到34-35°C)和转速(转速不可过快,否则会打碎细胞,基本上标志为平行)。一定要注意监控。3.温度达到34°C时开始计时,第一次为10分钟,以后可为8分钟,事情况而定。在此期间,在试管架上摆上5、6个离心管,标上1、1,2、2。其中在1号两管事先加入DMEM液各2毫升4.10分钟后,把三角烧瓶取卜*,磁力搅拌器关上,用一个吸管轻轻吹打(使消化下来的细胞彻底从组织团快上掉下来),这个吸管(1)用后固定放在一个离心管中,以后每次消化后取下都用其吹打儿下,第一次上清弃去,然后向两个1号管分别倒入2ml上清(尽量不要把组
8、织倒出,也不要剩液太多,以免消化下的细胞重复消化造成损伤),用另一个吸管(2)混匀配平两个管(即两个管水平高度相同),轻轻吹打,以免损坏细胞。5.接着把这两个离心管放入离心机中,调10分钟,800或1000转,垫小锁,打开关。6.同时向三角烧瓶中加入5ml胰酶,继续消化8分钟,注意控制温度。此吋向两个2号管中分别加入2mlDMEM液。7.取下三角烧瓶,仍用1号吸管吹打,后静置片刻向两个2号管分别倒入2毫升的上清,取出两个离心后的1号管,把上清液沿细胞贴壁一方慢慢倒掉,后向其中一管加入4ml的DMEM液,用2号吸管取少量液体加入另一个离心管中,把管底的沉淀
9、细胞洗下来,把液体全部移入其中一管,三个管(1个1号管,两个2号管)配平,放入离
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