乳鼠原代心肌细胞培养方法与技巧.doc

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1、细胞培养技术现已广泛应用于生物学和医学研究领域。心肌细胞培养作为一种体外试验研究模型，可以更方便地从细胞和分子水平研究心血管疾病的发病机制。体外培养的心肌细胞作为多种细胞病理模型广泛应用于生理病理和药理研究2S其最主要的优点是具有自发搏动性，可以不受神经体液因素条件下各种药物对活细胞的影响，并且可以节约动物及药品,从而提高效率。分离培养出高纯度的心肌细胞是对心脏相矢疾病进行各种研究的前提和基础。虽然心肌细胞的培养方法已早有报道，但均存在细胞存活率低纯度不高等诸多缺陷，如何使心肌细胞培养的方法更为简单，并且使分离的心肌细胞达到理想的存活率和纯度，是体外培养心肌细胞模型的尖键问题。为此笔者

2、在多年新生大鼠心肌细胞培养的经验和方法的基础上加以改逬，获得了简单并且稳定、可靠的心肌细胞培养的方法，现报道如下。1材料与方法1.1试验动物SPF级1〜3日龄4大鼠,河北北方学院实验动物中心提供，雌雄不拘。1.2试剂胰蛋白酶和胶原酶，美国Signa-aidrich公司产品;胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司产品；DMEV1干粉培养基，美国Gibco公司产品。1.3培养方法取1〜3日龄4大鼠乳鼠10只,用大头针将乳鼠的头和四肢固定，用75%酒精棉球消毒胸腹部皮肤;剪开皮肤,暴露皮下组织，更换手术器械,在大鼠剑突处横剪，于剑突处正中线稍偏左处向上剪，成倒T型，在心脏跳动下用眼科鰻迅速

3、夹取心脏放入盛有用冰预冷的FBS液体的平皿中；洗去血凝块和红细胞，用眼科锡将心脏包摸和附着的血管分离干净，剪去心房组织，取心室肌放入青霉素瓶，洗去残血后将心室肌剪成碎块（约1mm3）;用PBS再次清洗血污，加入10〜15mL0.125%胰酶（含0.02%的ED1A）,收稿日期：2009一11-23;修回日期：2010一05-30作者简介:王丽（1979-）,女，讲师，硕士,wanglini2004@si2nacan热磁力搅拌器搅拌预热到37°C（搅拌速度60〜100r/min）,消化8min;弃上清液，再次加入胰酶继续消化剩余组织,重复消化直至碎片几乎完全消化；分别收集各次消化后的上

4、层细胞悬液置于冰上，经200目不锈钢网过滤以去除未消化的组织及细胞团，并马上加等量的10%血清培养液以终止反应，1500r/min^心8min;弃上清液，加入1mL血清培养液，吹散沉淀细胞，再次禺心（1500r/min禺心8min）;弃上清液，用10%血清培养液制成细胞悬液，按差速贴壁分离法纯化心肌细胞，以5>40’个/L接种于培养瓶中，置37°C、5%CO2培养箱中培养1.5h;此后每2d换液1次;加入终浓度为Q1mmol/L5-漠脱氧核昔以抑制成纤维细胞的增殖。1.4形态学观察生长第3天在倒置相差显微镜下观察心肌细胞的形态学变化并摄像。1.5心肌细胞的鉴定心肌细胞免疫组化鉴定一般采

5、用的蛋白是a-横纹肌肌动蛋白。a•横纹肌肌动蛋白仅存在于心肌细胞和骨骼肌细胞中，在心肌中不存在骨骼肌细胞，因此笔者采用链霉亲和素•生物素•过氧化物酶（问C）免疫细胞化学法检测横纹肌肌动蛋白的表达来鉴定心肌细胞。2结果21原代培养的心肌细胞形态学观察在倒置相差显微镜下观察发现，刚接种的心肌细胞悬浮于培养液中。培养3h后，心肌细胞逐渐贴壁，呈忧形;培养12h后,心肌细胞已贴壁生长，呈三角形或扁平形，偶有自发性搏动,搏动频率较慢，有的每分钟仅数次。培养24h后，细胞已全部贴壁，贴壁后呈梭形三角形或不规则多边形（见图la）;胞核小,1员1而致密并居中;胞质颜色较深，核周胞浆可见颗粒样物质；90

6、%开始搏动。培养48h后，细胞逐渐在皿底表面铺展，并伸出伪足，形成不规则的星形并相互接触交织成网现图1b）,出现自发搏动;培养72h后，心肌细胞融合成片形成单细胞层（见图1c）局部细胞生长密集处可形成呈放射状排列的细胞簇，同簇细胞搏动同步化现图Id）,每分钟120次左右。22心肌细胞横纹肌肌动蛋白的免疫细胞化学染色a培养24h心肌细胞贴壁生长(100培养48h心肌细胞伸出伪足相互连接(200M;c培养72h心肌细胞融今成片(100M;d培养72h心肌细胞鬆集成团并同步搏动(400力。图1倒置相差显微镜下乳鼠心肌细胞的形态用免疫细胞化学方法对心肌细胞进行鉴定。图2为心肌细胞横纹肌肌动蛋白

7、单克隆抗体染色的结果。由图2可见:细胞胞浆呈棕黄色细密颗粒，阳性细胞大部分细胞染色呈阳性(胞核呈蓝紫色)(见图2b)，阳性细胞与在倒置显微镜下观察到的心肌细梅形态一致,细胞胞体较小，呈梭形或多角形，核仁漬晰;心肌细胞呈阳性反应。结果显示心肌细胞分离、纯化效果好，95%以上的细胞中横纹肌肌动蛋白染色均呈阳性，提示所培养的心肌细胞的纯度高，基本无其他细胞污染，表明此方法培养的心肌细胞可以满足后续试验的要求。a阴性对照(FBS代替一抗吋心肌细胞免疫组