[精品]原代心肌细胞培养技巧【转】.doc

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1、原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型，被广泛丿应用于心血管研究Z屮.我们实验室经过长期尝试，摸索出了一些行之有效的方法，并积累了一些经验，现总结如下：1新生大鼠鼠龄的选择新生大鼠心肌细胞在出生品3d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力•因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长•大量观测表明,选择1〜3d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想•其中尤以半口龄大鼠心肌细胞培养效果最佳.2消化酶的选择及使用新生大鼠心肌细胞的分离可采用纟R

2、织块法和消化法,前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用.消化法屮常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或II以及透明质酸酶.透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用.胰蛋白酶作用校强，容易造成心肌细胞损坏.胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质屮的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原1为主，故我们选川胶原酶I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6-1g・L1,我们使用的为0.8g・L1.胶原酶最好现用现配.3消化程度的把握新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感.消化过

3、度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测•消化过程屮使用磁力搅拌器时丿应注意1)转速一般控制在60-80r・mini左右.(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定.(3)将粘附在搅拌了上的心肌组织吹散，使酶液充分接触纟H.织.(4)适宜温度为35~37°C.⑸当纟R织由红转白呈半透明状态时，应停止消化.4接种的细胞密度心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而H影响长期培养细胞的成活率.接种

4、细胞的绝对数最应经精确计算.一般而言，)2根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量•例如，如作形态学观测，六孔板屮每孔的接种细胞数量应控制在lxlO5

5、，可将培养板放入孵箱后用滴管轻轻吹打各孔屮央部位2〜3次，但应格外注意避免污染.6对成纤维细胞的抑制与血清种类的选择成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，经芳速贴壁示仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞Z屮，若处理不当，很容易生长成优势细胞.溟脱氧尿背(bromodeoxyuridine,BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长.但是，如果使用胎牛血清培养细胞，由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这

6、种现象的出现，获得高达90%以上的心肌细胞.7换液时间进行心肌细胞形态学观测时，接种密度较低，贴壁的心肌细胞数量减少，为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃，应在接种48h后换液.这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加，而且BrdU作用时间较长，对成纤维细胞的抑制作用更确实.此外，去血清后可用ITS和0.1g・L1BSA对心肌细胞进行营养支持，对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响.8抗污染措施除应注意无菌操作等常规技术方法外，还应特别注意以下儿点：(1)获取心脏时避免剪破消化道.比较稳妥的办法是在剑突上一

7、-肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会.(2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染.(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则既会导致培养液pH改变，又能增加污染机率.9培养液pH值适宜的pH范围在7.2〜7.4之间，配制及使用培养液时应注意：(1)pH值会在过滤后上升0.1〜0.3.(2)培养液中加入血清后pH值会有降低，降低稈度与血清品质和含量有关.(3)应及时换液.(4)配制好的培养液不宜长时问贮存在4C.这是因为培养液屮的CO

8、2会溢出，使培养液pH上升.每次配好的培养液尽量在2wk内用完，否则应部分置于一20°C保存，使用前应补充谷氨酰胺和NaHCO3,再次过滤后方可使用.