改进乳鼠原代心肌细胞培养.doc

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1、改进乳鼠原代心肌细胞培养一、器材及试剂准备1、4个烧杯（1个装棉球及酒精，1个装人鼠，2个川于盛75%洒精），离心管架，冰袋；2、消毒用具：（1）高压饭盒内装：棉球、3把小剪子（1把剪皮狀，1把剪肋骨，1把用于剪碎心脏）、2把辍子（大铁子用于夹取灭菌后的器具，小银子用于夹取心脏等）、玻璃离心管、培养1111等；（2）玻璃吸管;3、试剂：（1）过滤除菌的D-Hanks液；（2）含10%胎牛血清的DMEM；（有的用小牛血清，因为其营养成分少，可抑制纤维细胞的生长）（3）不含EDTA的0.125%胰酶;（4）0.08%的胶原酶II；（5）10mmol/L的储存液BrdU（需避光保存），使用时需要

2、以1:100的浓度稀释,直接加入培养瓶中；（6）75%酒精。二、细胞培养（15只人鼠）1、将棉球放入含育75%酒精的烧杯，将完全培养基倒入玻璃培养皿屮，置于冰袋上；2、将饭盒打开，将饭盒盖里面朝上放置，用已用紫外照过的人锻子取出2把剪子，1把铁子，沿着饭盒盖摆好备用，用人铁子将离心管夹出放在架子上备用；3、用大铁子将小鼠从垫料屮取出，放入盛有75%的酒精缸I中，10s,取岀，放入另一个盛有75%的酒精缸II中，10s,取出；4、取出一•个用酒精浸泡过的棉球，垫于人鼠腹部，以防収心脏时手套被血污染；5、左手食指和屮指夹住小鼠头部，拇指夹住其右上肢，无名指和小指夹住其下腹部，剪刀I从剑突下沿胸

3、骨剪开皮肤，再用剪刀II剪开肋骨，可见心脏蹦出，用银子将心脏夹出，放入含有血清的DMEM中，用毁子将心脏中的血挤出（每处理完一只人鼠，均要用酒精棉球将剪子和银子擦干净）；6、将心脏全取出，挤完血后，将培养基吸出弃去，加入无血清DMEM,并用剪刀II及辍子将心房和血管除去；7、将无血清DMEM及心房和血管组织吸净，用剪刀III将心脏剪成碎，成泥状；8、用0.125%的胰酶4nil吹悬剪碎的心脏组织（可逐步加至4ml,15只人鼠用4nil胰酶），并将之移到离心管中；9、水浴：将离心管放到水浴锅中，振荡5min,弃上清；10、再向离心管小加入3.5ml的胰酶（胰酶用量逐渐减少，防止细胞过度消化）

4、,振荡水浴lOmin,将上清和沉淀分别吸出，分别放到两个新的离心管屮；（丝状的物质内含有丰富的细胞，应将它放入盛细胞的离心管屮）11、向有细胞的离心管中加入含有血清的DMEM终止消化,向有沉淀的离心管加入3ml的胰酶，继续水浴lOmin,将上清和沉淀分别吸出，放到两个新的离心管屮；12、将胰酶的量减至3ml,重复步骤10-11;13、向含有沉淀的离心管中加入2.5ml胰酶+2.5ml胶原酶II,水浴消化lOmin,将上清和沉淀分别吸出，放到两个新的离心管中；14、向有细胞的离心管屮加入含有血清的DMEM终止消化，向有沉淀的离心管加入2m1的胰酶+2ml胶原酶II,继续水浴lOmin,将上清

5、和沉淀分别吸出，放到两个新的离心管15、重复步骤14-15,共计消化8次；（理想状态：无肉眼可见的组织块，每次水浴后可见上清浑浊，吸取时可见丝状物）16、将含有细胞的离心管离心，1000rpm*10min;17、将每个离心管屮的H色块状沉淀以及漂浮着的丝状物吸岀，放入一个新的试管屮，加入适量含有血清的DMEM,吹悬细胞，并将Z种到培养瓶或培养皿屮，以1:100的比例加入10nunol/L的BrdU抑制心肌细胞的生长。（15只人鼠种了5个小培养皿）