胎鼠原代心肌细胞之mir

《胎鼠原代心肌细胞之mir》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、胎鼠原代心肌细胞之miR第一部分miR-17-92对FOG-2基因3UTR的作用心脏发育是一个很精细的过程，受到很多转录因子的调控，其中转录因子FOG-2基因在心脏发育过程中担当很重要的角色，FOG-2-/-基因敲出小鼠于胚胎期E13.5天左右因心脏缺陷导致胚胎期致死，其心脏发育缺陷主要包括心肌发育不良心室壁变薄、大的室间隔缺损、严重的房室心内膜垫缺失、主动脉骑跨和严重的冠状动脉血管丛发育不全。miRNAs在心脏发育过程中调控很多关键因子，其表达的异常可能会引起严重的心脏发育缺陷，我们推测FOG-2基因也可能受miRNAs的调控，因此我们通过

2、生物信息学方法分析了FOG-2基因的3UTR全长发现有62个miRNAs为潜在的结合位点，并且62个候选miRNAs中有5个miRNAs属于miR-17-92基因簇中，分别为miR-17-5p、miR-19a、miR-19b、miR-20a和miR-92a，并且其种子区的2-8位与FOG-2基因3UTR精确互补配对。同时文献报道了miR-17-92-/-基因敲出小鼠出生后不久即死于心肺衰竭，心脏缺陷表现为室间隔缺损和心肌发育不良。FOG-2和miR-17-92基因簇在心脏发育过程中担任很重要的角色，miR-17-92能否直接作用于FOG-2基

3、因的3UTR为本研究的内容之一。1材料与方法1.1实验材料人胚肾上皮细胞HEK293T细胞株：华西科技园基因工程小鼠中心保种1.1.2细菌大肠杆菌DH5α：购于Stratagene公司，华西科技园基因工程小鼠中心保种1.1.3质粒pGL3-PromoterVector:购于Promega公司，华西科技园基因工程小鼠中心保种pRL-SV40Vector:购于Promega公司，华西科技园基因工程小鼠中心保种pcDNA3.1(+)Vector：购于Invitrogen公司，华西科技园基因工程小鼠中心保种1.1.4细菌用培养基LB液体培

4、养基（1L）：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，加水至1000ml，PH7.5LB固体培养基（1）：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂糖15g，加水至1000ml，PH7.5DNA提取缓冲液：0.1MNaCl，50mMTris-HCl（PH8.0）,2.5mMEDTA,0.5%SDSTSB溶液（10ml）：LB7.3ml（PH6.1），50%PEGMSO0.5ml，1MMgCl2100μl，1MMgSO4100μl培养基用抗生素：氨苄青霉素50mg/ml，卡那霉素60mg/ml1.1.5细胞用培养基DMEM低糖培养

5、基：购于GIBCO公司FBS胎牛血清：购于民海生物工程有限公司细胞培养基用氨苄青霉素和卡那霉素均购于GIBCO公司0.25%胰蛋白酶：购于GIBCO公司1DPBS缓冲溶液（不含钙镁离子）：购于GIBCO公司2实验结果2.1生物信息学分析FOG-2基因3UTR潜在结合位点及保守性为确定FOG-2基因的潜在microRNAs靶向作用，我们首先利用生物信息学方法分析了FOG-2基因的3UTR全长序列，如（图1.A）所示FOG-2基因位于人类第15号染色体qB3.1区，FOG-2基因3UTR全长1011bp且富含AU富集元件（AU-richeleme

6、nts，AREs）。AREs为3UTR的一段具有调控功能的序列和mRNA的稳定性相关，具有促进mRNA降解的作用[25]。在UCSC数据库中FOG-2基因同源性分析发现3UTR在人类、鼠类、马、大象、蜥蜴、鸡等物种进化过程中相当保守。接着我们在microRNA数据库中）确定了62个miRNAs潜在的结合位点，并且62个候选miRNAs中有5个miRNAs属于miR-17-92基因簇中，分别为miR-17-5p、miR-19a、miR-19b、miR-20a和miR-92a，并且其种子区的2-8位与FOG-2基因3UTR精确互补配对（图1.B）

7、。2.2miR-17-92前体克隆及表达载体构建以C57BL/6J小鼠基因组为模板扩增miR-17-92前体，扩增片段长度1102bp（图2.A）将扩增的miR-17-92片段酶切后插入pcDNA3.1(+)质粒中，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中挑取单菌落扩大培养后提质粒行EcoRI和XhoI双酶切鉴定（图2.B），经鉴定正确的质粒进一步测序确认正确的质粒命名为pcDNA3.1-miR-17-92。第二部分miR-17-92转录后调节...................51-751材料与方法.................

8、..51-622实验结果...................62-693讨论...................69-73