鼠牙囊细胞的原代分离培养方法

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1、鼠牙囊细胞的原代分离培养方法本文档格式为WORD,感谢你的阅读。最新最全的学术论文期刊文献年终总结年终报告工作总结个人总结述职报告实习报告单位总结演讲稿鼠牙囊细胞的原代分离培养方法　　牙囊在牙萌出时期占据的天然重要位点使其在调节破骨和成骨平衡、牙槽骨活性、牙萌出发挥重要作用，下面是一篇探究鼠牙囊细胞原代分离培养方法的，供大家阅读查看。　　牙囊(Dentalfollicle,DF)起源于外胚间充质，是包绕在成釉器周围和牙乳头底部呈囊状排列的结缔组织，其在牙齿萌出后期可形成牙骨质、牙周膜和固有牙槽骨。牙囊是牙萌出的必需条件之一[

2、1],并在组织、细胞和分子等多个水平上调控牙齿的萌出[2-3].Wise等[4](1992)首次报道了采用改良组织块酶消化法进行大鼠牙囊细胞的体外培养，凌均棨等[5-6]、叶国[7]、刘晓辉等[8]也采用不同或类似的方法先后进行了大鼠牙囊细胞体外培养并取得成功。而小鼠牙囊细胞的原代分离培养仅有葛少华等[9-10]采用改良组织块培养法获得成功，国外尚未见相关报道。小鼠作为应用最广泛的模式动物之一，在牙萌出领域的研究中具有其他动物无法比拟的优势。但小鼠牙囊细胞的分离培养却较其他动物困难，大大限制了其应用范围。本实验通过比较酶消化

3、-组织块法和二次酶消化法在小鼠牙囊细胞原代培养中的优缺点，以期为进一步研究牙囊细胞的生物学特性奠定基础。　1材料和方法　　1.1主要试剂、仪器和实验动物　　α-MEM培养基(Hyclone,美国);胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco,美国);I型胶原酶(Sigma,美国);EDTA、青霉素、链霉素(西安科昊生物);丙酮酸钠(北京中生瑞泰);PBS(西安国安生物);细胞培养板(广州洁特);低速离心机(长沙湘仪);温控水浴机(上海精宏);超净工作台(Airtech,苏净安泰);细胞培养箱(ThermoScientific,美国);倒

4、置相差显微镜(Leica,德国);Balb/c仔鼠(第四军医大学实验动物中心)。　　1.2牙囊组织的分离和获取　　参考Wise等[4]报道的方法并进行改进。取6只出生3~5d的Balb/c仔鼠，分别经脱颈法处死，750mL/L乙醇浸泡消毒1min后，外科法分离出1霉素和100μg/mL链霉素)中。体视显微镜下剥离牙胚周围的骨组织，分离出各小鼠的下颌第一磨牙和第二磨牙牙胚，并置于预冷的α-MEM培养基中。收集所有牙胚置于200μL(2g/L)I型胶原酶消化液中，37℃水浴20min后，将牙胚转移至预冷的α-MEM培养基中;然后

5、在体视显微镜下分离牙囊和成釉器，并将剥离出的牙囊组织立即置于预冷的α-MEM培养基中待用。　　1.3牙囊细胞的原代培养　　1.3.1酶消化-组织块法　　取上述方法获得的牙囊组织，分散成小块后以0.5cm的间距直接接种于24孔板，放置2~5min待组织块稍干并贴壁后，每孔加入含胎牛血清(200mg/L)、丙酮酸钠(0.1g/L)、青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)的α-MEM培养基各500μL(注意避免组织块浮起)，置于37℃、50mL/LCO2、饱和湿度条件下进行培养。　　次日轻吹悬浮未贴壁组织块，并用预温

6、的培养基进行半量换液，倒置相差显微镜下观察;此后每2d半量换液1次，并严密观察细胞的状态，待细胞生长接近80%汇合时进行传代。　　1.3.2二次酶消化法　　取上述获得的牙囊组织，用眼科剪剪成1mm×1mm×1mm大小的组织块后，置于500μL(2g/L)Ⅰ型胶原酶消化液中，37℃水浴1h,消化期间每10min振荡1次悬浮组织。消化结束后，200目筛网过滤细胞悬液，1000r/min离心5min,弃上清;沉淀部分用1mLα-MEM培养基(配方同1.3.1)重悬后，接种于24孔板，置于37℃、50mL/LCO2、饱和湿度条件下进

7、行培养。次日轻吹悬浮未贴壁细胞，并用预温的培养基进行半量换液，倒置相差显微镜下观察。此后每2d半量换液1次，待细胞生长接近80%汇合时，则进行传代。　　1.4牙囊细胞的传代培养和分离纯化　　在上述原代培养中，酶消化-组织块法培养共进行29次，二次酶消化法培养共进行32次。传代时均加入2.5g/L胰蛋白酶和0.2g/LEDTA复合消化液，并置于37℃下消化8~20min;当显微镜下观察到大部分细胞胞体收缩变圆，且部分细胞悬浮时，加入含血清的α-MEM培养基终止消化，并反复吹打20次(吹打过程中尽量避免产生气泡)。　　然后收集细

8、胞悬液，1000r/min离心5min,弃上清;沉淀的细胞用新鲜培养基重悬后，1∶2传代培养(培养条件与原代培养相同)。　　1.5倒置相差显微镜观察牙囊细胞　　倒置相差显微镜下观察不同生长阶段细胞，拍照前4h轻吹悬浮死亡细胞，然后更换预温新鲜培养基，置于孵箱中继续培养4h后取出并拍照。