原代细胞的培养法.doc

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1、原代细胞的培养法组织块培养法组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方法，故原先被称为组织培养。英方法：为将剪成的小组织团块接种于培养瓶（或川L）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长，方法简便，利于培养，部分种类的组织细胞在小块贴唯24小时后细胞就从组织块四周游出，然后逐渐延仲，长成肉眼可以观察到的生长晕，5~7天后组织块屮央的纽织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮，此漂浮小块可随换液而弃去，山纽织块周用延伸的贴琨细胞也逐渐形成层片，可在显微镜下观察形态和用于实验研究。其培养方法如下：（1）按

2、照前述方袪取材，将组织剪成或切成大小的小块，并加入少许培养基使组织湿润。（2）将小块均匀涂布于瓶壁,每小块间距0.2cm~0.5cm,一般在25mL培养瓶（底面积为17.5cm2）M接种20~30小块为宜，小块放置后，轻轻翻转培养瓶，使瓶底朝上，然后于瓶内加入适最培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37°C温箱内。（3）培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和來回振荡，以防山于冲动而使小块漂起而造成培养失败,若组织块不易贴堆可预先在瓶堆涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多,以保持组织块湿润即可，培养24小时后

3、再补液,培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始儿天尽杲不去搬动，以利贴壁和生长，培养3~5天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。原代细胞培养2、消化培养法该方法是采用前述的消化分散法，将妨碍细胞生长的细胞间质（包括基质、纤维等）去除，使细胞分散形成细胞悬液，然后分瓶培养。某些特殊类型细胞，如内皮细胞、骨细胞等的消化手段和步骤，将在有关章节屮叙述。3、悬浮细胞培养法对于悬浮生长的细胞，如口血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化,可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。4、器官培

4、养•器官培养是指从供体取得器官或组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养，其特性仍保持原有器官细胞的组织结构和联系、并能存活，器官培养的H的和技术均与单层细胞培养不同，但可利用器官培养对器官组织的生长变化进行体外观察。并观察不同培养条件研究对器官组织的影响。器官培的生物调节作用。体外器官培养为临床上的器官移植创造J'便利的条件。器官培养的条件与细胞培养不同,要有特殊的要求。养可保持器官组织的相对完整性,町用于匝点观察・胞间的联系、排列情况和相互影响,以及局部环境1、器官培养的特殊的要求（1）需要特殊的培养条件因器官离体培养,其营养和氧气仅靠自然渗

5、透來供给，因此，培养时为了确保中心不发生缺乏氧和营养而造成坏死,其厚度或直径不宜超过1mm.（2）器官内部细胞需要有足够的氧气渗入常采用以下两种方法：a.将器官组织块置于培养基气液面以利于气体交换•b.提高培养基屮的氧分压，一般需加注纯氧，提高氧分压时仍需保持5%C02,以维持pH.2、器官培养的方法（1）将不锈钢网做成的支架，放置于培养皿中,高度为”2皿高,使其表面铺上0.5mm孔径的滤膜。（2）将培养基加入平JHL+，使培养液刚刚接触到滤膜，但不要使滤膜浮起。（3）将要培养的器官组织平放在滤膜上，一般:厚度不要超过200pm,水平面积不超过lOmnA如为肝、

6、肾不能大于1mm2.（4）将培养物置于CO2培养箱内，并加注氧气，调整氧分圧达90%,培养时注意使液面与膜保持在一致的水平上。（5）上述器官培养1~3周（每隔2~3天换液一次）后可用于实验和检测。