动物细胞的原代培养.doc

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1、动物细胞的原代培养细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养，使其不断生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现彖。细胞培养的突出优点，一是便于研究备种物理、化学等外界因素对细胞生长发冇和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构（如细胞骨架等）、细胞生长及发冇等过程的观察。其特点包括：大量实验材料；单一、纯粹细胞类型培养基的成分可控，即生长条件可控/全合成、无血清培养基；易于观察；易于操作。细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的一种简

2、便易行的实验技术。一、实验目的了解动物原代细胞培养的基木方法及操作过程；初步掌握无菌操作方法；观察体外培养细胞的生长特征。二、实验原理原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成单个游离的细胞，在人工培养下，使具不断地生长及繁殖。直接从身故体内分离的细胞，在体外培养的过程屮尚未发生细胞分裂、增殖的细胞即为原代培养细胞；原代培养细胞在一定条件下可以继续增殖，在数量上大量扩增，此时的细胞为继代培养细胞。细胞

3、培养是一种操作繁琐而乂要求-I•分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基木要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因了、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。三、实验用品1.器材%1解剖剪、解剖银、眼科剪、眼科锻、培养川L、纱布块、移液管、橡皮头、培养瓶、玻璃匀浆器、1.5ml离心管等。上述器材均需彻底清洗、烤干、包装好，高压灭菌2（）min,备用。%1倒置显微镜、离心机、酒精灯、酒精棉球、试管架、记号笔、大头针、解剖板等2

4、.试剂完全培养液不完全培养液90%10%小牛血清双抗（链霉索、青霉索）（1万单位/mL）加至约为100单位/mL7.4%NaHCO3调pH至7.0-7.2。不完全培养液：DMEM液或1640液PBS缓冲液或生理盐水以上溶液均经适当包装，灭菌后备用。（细胞培养基要满足细胞的生长需要，包括pH、渗透压、营养和生长因子等以保证细胞的增殖。细胞培养箱常指二氧化碳培养箱，它可以提供合适的温度和二氧化碳浓度。二氧化碳和培养基中的缓冲系统共同作用，保持细胞培养液的酸碱度。超净台通过将空气进行过滤，为细胞培养的各种操作提供了一个干净的环境，使

5、细胞培养免于细菌和真菌的污染。在细胞原代培养的操作过程中，这个设备是必要的，细胞本来就比较易感染，不易存活，在空气中，以及人体表面存在许多易感染细菌，所以为了提高细胞的存活率，一定要保持操作过程干净，无污染。）1.材料：小白鼠四、实验方法1.拉颈处死小白鼠示，将小白鼠放入超净工作台屮盛有70%的洒精的烧杯屮灭菌5min。将小白鼠用大头针固定在解剖板上，使其腹部向上。2.在小白鼠腰部后缘（腹部左侧），用解剖银提起皮肤，用解剖剪剪开皮肤，将剪开的皮肤分别拉向两侧。此时，再换一把解剖剪及解剖辍，剪开腹腔膜，暴嘉出腹腔，即可见脾脏（肝

6、脏或肾脏等）。用弯头眼科银取出脾脏（肝脏或肾脏等），置于无菌培养1111屮，去除脂肪等，用不完全培养液（或PBS液、生理盐水）冲洗。3.用眼科剪及银了，将脾脏剪成小块（lmm2）o将剪碎的脾脏转入玻璃匀浆器屮，加入少量不完全培养液进行匀浆。匀浆后将匀浆液转入1.5mL离心管屮，KXXkpm离心5min。弃上清，重悬于不完全培养液中。4.如仍有较大组织块，将悬液通过200目不锈钢网，离心洗涤一次（lOOOrpm,离心5分钟，弃上清液）。5•加入完全培养基，反复吹打沉淀，肓到沉淀均分散成混淆的细胞悬液为止。血球计数板计数。6•培养

7、瓶屮预先加入适量完全培养基（以覆盖住瓶底为宜）。将上述细胞悬液分装于培养瓶屮，盖紧瓶塞。将细胞调整到5xl05/ml左右。细胞计数方法：%1试剂配制：用生理盐水配成5%TyrpenBlue（台酚蓝）染液，备用%1染色计数:取0.5mL细胞悬浊液放入试管中，加入1-2滴染液。混合。2-5min后将细胞放在血事血球计数板细胞计数板上观察死活情况，注意不要有气泡产生，放丸倍数为10xl0o染色后活细胞不着色，死细胞显示蓝色。注意染色时间不能超过15min,否则染液将细胞毒杀。%1计数：在10x10倍的显微镜下观察，计算血细胞计数板的

8、4个4小方格的细胞数量。包括细胞总数与死细胞数量。压线者计上不计下，计左不计右。7.将培养瓶放置于倒置显微镜下观察细胞形态。8.将培养瓶置于CO?培养箱屮进行培养。9.观察置于37°C培养的细胞，需逐LI进行观测，主要观察：①培养物是否被污染，如培养液变成黄色且混浊，表示该瓶