动物细胞原代培养.ppt

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1、实验一动物细胞原代培养一、实验目的1．掌握动物细胞培养的无菌操作技术。2.掌握动物细胞原代培养的基本方法。二、实验原理原代培养(primaryculture)是指取自体内的新鲜组织、细胞，在体外条件下生长至传代之前细胞培养阶段，是细胞培养的最初和必经阶段。原代培养方法主要有组织块贴壁培养法和分散细胞培养法。组织块贴壁培养法是将切成小块的组织贴附在适宜的支持物上，细胞从组织块边缘游离、生长，形成单层细胞即为原代培养细胞。分散细胞培养法是通过酶消化或机械分离，使组织分散成单个细胞，然后开始首次培养的方法。三、实验材料1．动物材料出生2周内的大鼠。2．实验试剂（1）D-H

2、ank’s液（2）75%乙醇（3）0.05%Ⅳ型胶原酶液（4）DMEM培养基（5）小牛血清（6）双抗溶液（7）0.4%台盼蓝染液3．实验器材超净工作台、倒置相差显微镜、CO2培养箱、水浴锅、离心机、眼科剪、眼科镊、移液器及枪头、培养皿、烧杯、细胞培养瓶、吸管、离心管、血球计数板、载玻片、盖玻片、200目不锈钢筛网、酒精灯、75％酒精棉球、记号笔等。四、实验方法与步骤1．取1只大鼠，颈椎脱臼法处死，浸入75%乙醇消毒。2.将小鼠置于超净台中的大培养皿中，背部朝上，用75%酒精棉球擦拭其整个背部皮肤。3．用眼科镊提起小鼠腰部皮肤，用眼科剪横向剪开皮肤，稍用力将剪开的皮肤

3、拉向两端，暴露腰部。更换解剖器械，剪开腰部的肌肉、被膜，取出肾脏，置于培养皿中。4.更换解剖器械，去除肾被膜，去除肾盂，用含有双抗的D-Hanks液清洗3次，剪取肾皮质部分，移入小烧杯中，加入少量D-Hanks液，剪成1mm3左右的组织块。用D-Hanks液清洗3次，吸去上清液，尽量去除血细胞。5．向组织块中加入0.05%Ⅳ型胶原酶消化液，37℃水浴振荡消化5分钟后，用吸管吹打数次，吸取上清于离心管中，4℃冰箱保存，向剩余组织块中添加胶原酶消化液，继续37℃水浴振荡消化，每隔5分钟，用吸管反复吹打，收集上清液，直至组织块完全消化。全部上清液在4℃、800rpm条件下

4、离心5分钟，弃去上清液，向沉淀中加入培养液，吹打成悬液。6.用200目不锈钢筛网过滤，去除较大组织块，滤液在4℃、500rpm条件下离心5分钟，弃去上清液。向沉淀中加入3mL含10%小牛血清的DMEM培养液，重悬细胞。7．用血球计数板进行细胞计数及其存活率，将细胞以（3～5）×105个/mL密度接种于25mL培养瓶中，每瓶加入细胞悬液3mL。在培养瓶上标注组织来源、实验者姓名和实验日期。将培养瓶移入37℃的5%CO2培养箱，静置培养。8.逐日观察细胞的生长状态。2天后进行换液，去除悬浮在培养液中的无活性细胞。待细胞铺满瓶底，可进行传代培养。五、实验结果1.分离细胞培

5、养法实验中，细胞12小时贴壁，24小时可见细胞从小细胞团周边生长，2～3天可长成单层，细胞呈扁平不规则多边形，鹅卵石样排列。六、注意事项1．原代培养过程中所使用的解剖器械、培养基、溶液、器皿等要经过高压灭菌或过滤除菌后方可使用。2．解剖动物和取材的各个步骤应更换解剖器械，以免细胞被污染。3.在CO2培养箱中，若选用的培养瓶螺旋盖不带有滤膜，则应将瓶盖拧松，保持通气状态。4．实验过程中，实验人员要严格遵守无菌操作流程。动作要轻柔，安装吸头、打开或封闭瓶口等操作应在火焰近处并经过烧灼后进行。操作时，避免讲话、咳嗽，以防唾沫或呼出气流造成污染。取用液体前不宜过早开盖，使用

6、完毕应立即封闭瓶口。吸取液体或细胞悬液时，应专管专用，一旦吸管前端接触了手或其他污染物时应更换，吸出后残留的液体不可重新加入原瓶，以防污染扩大或造成培养物间的交叉污染。5.实验结束后，应将实验废液或废物及时移出无菌室，并用消毒水擦拭超净台，保证清洁。七、思考题1．结合实验记录，描述分散细胞法培养的乳鼠肾细胞原代细胞的生长特点。2．分析影响原代细胞培养的主要因素。