《细胞原代培养》ppt课件

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1、细胞的原代培养（研究生实验教学）实验目的熟悉细胞培养的基本条件和准备工作熟悉并掌握原代培养中取材、消化、收集细胞和接种等基本实验技术了解细胞原代培养的原理及其方法实验原理原代培养（primaryculture）从供体取得组织细胞在体外首次培养。细胞分化、药物测试、细胞株建立等基本方法组织块法和消化法a.组织块法：直接将组织块接种于培养瓶，24小时就有细胞向四周游出。简便、易行，适合于来源有限、数量较少的组织做原代细胞培养b.消化法用酶消化、分解妨碍细胞生长的间质（基质、纤维等），形成单个细胞或细胞团对上皮、肝、肾、胚胎等间质少、较软组织选择胰蛋白酶对骨、前列腺、癌组织等纤维多、较硬的

2、组织可用胶原酶短时间内可获得大量活细胞主要实验器材培养箱二氧化碳恒温箱，5％CO2，37℃，保持湿度，消毒灭菌。倒置显微镜可观察活细胞，直接观察培养瓶或培养板，带拍摄等功能。离心机普通离心机（500～4000rpm），高速离心机（1000～15000），冷冻离心机等（离心力转换成转速：g＝1.118×r2×10－5）超净工作台紫外消毒，鼓风，保持干净、整洁高压锅用电，带压力表，自动恒压，掌握时间橡胶、塑料、药品——15’，金属——20’培养瓶玻璃瓶和塑料瓶，洗涤要干净，临时消毒培养基a.天然培养基：血清、胚胎浸出液、水解乳蛋白等b.合成培养基：DMEM、RPMI1640、199培养基

3、等c.无血清培养基：HamF12和DMEM混合的基础培养基、自行设计与配制的培养基（加其他成分）其它常用液消化液0.25％胰蛋白酶溶液、0.02%EDTA溶液、胶原酶。消化酶抑制剂0.1％～0.5％大豆胰酶抑制剂NaHCO3溶液常用浓度7.4％、5.6％、3.7％HEPES溶液（羟乙基哌嗪乙硫磺酸）终浓度10～50mmol/L抗生素液青霉素和链霉素二者的终浓度都达到100U/ml主要实验准备工作一、培养用具的清洗浸泡清水浸泡数小时，新玻璃器皿泡5％稀盐酸12h以上（中和表面碱性物质）洗刷洗洁精、软毛刷，轻刷、多次、彻底浸酸（由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水配制）灌满，6h以上，最好过夜，去

4、污好冲洗充分，灌满-倒出10次以上，最后蒸馏水冲2～3次，烘干、包装。胶塞和塑料用品清洗清水浸泡后，2％NaOH溶液煮沸10min,自来水冲洗、晾干，1％稀盐酸浸泡30min,自来水冲洗，双蒸水冲3次，晾干、包装。二、物品包装同类物品包装一起，大小合适，包扎紧凑，多层包装，写上标签三、消毒器具常用压力蒸汽灭菌掌握时间：煮沸10～20min试剂消毒无机试剂可用压力蒸汽灭菌（插5～7＃针头）有机试剂过滤除菌，常用0.22µm超净工作台紫外灯照射30min以上培养室紫外灯照射2～3h/天操作步骤1.取材75％酒精浸泡乳鼠2min，取肝脏于平皿中PBS溶液洗涤3次去除液体后，剪碎成1～2mm

5、3小块2.消化加5～8倍组织量的胰蛋白酶溶液转移到离心管内，加盖37℃水浴15min，每5min摇晃1次终止消化：加1ml含血清的培养基DMEM3.过滤用400目不锈钢筛网过滤收集滤液于离心管4.离心平衡、离心5min，1000～1500rpm去上清，加PBS，混匀，离心（同上）重复上一步5.接种去上清，加3～5ml培养基，混匀，接种于培养瓶加培养基3～5mm深，盖紧盖，观察细胞密度6.培养放入培养箱，2天后观察，换液。