Promocell原代细胞培养ppt课件.ppt

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1、经验分享——原代细胞和干细胞培养中可能出现的问题CytokinesAntibodiesELISAsCellAssaysTransfectionReagentsHumanCellsOptimizedMediaClassicalMediaSeraCellCultureReagentsCellCultureCellBiologyTrainingCoursesThreePromoCellBrandsCellCultureMolecularBiologyQualityManagement1990年开始科学家指导科学家用“技术”取代“经验”用

2、“经验”取代“运气”细胞培养中产生问题的可能原因微生物污染(I)细菌污染培养基浑浊培养基变黄（pH值改变）显微镜下：移动的黑点或杆状物大小：1-5µm来源：操作人员/水浴不能再进一步培养丢弃!真菌污染培养基变黄（pH值改变）生长相对缓慢来源：气流显微镜下：菌丝体—主要是植物式的生长模式分枝菌丝—菌丝体，孢子生产能力强不要打开培养容器，直接丢弃！微生物污染(II)酵母菌污染培养基呈云雾状椭圆形，酵母细胞芽接，成链大约3-5µm来源：气流可以用抗真菌药剂清除（如两性霉素B和制霉菌素）微生物污染(III)支原体污染首次发现于1898

3、年，被定义为病毒是已知的能自我复制的最小原核生物直径为0.2-0.8µm能够通过孔径为0.45µm的纤维素和聚乙烯醇过滤器（由于其变形的能力，甚至能够穿过0.22µm宽的孔径！）缺乏细胞壁肽聚糖耐青霉素一般在培养中无明显的表象（肉眼不可见，显微镜下也不可见一般发生在胞外，只有极少数几率发生在胞内微生物污染(IV)微生物污染(IV)HK-2细胞(人肾近曲小管上皮细胞)复苏后细胞第一天贴壁，但细胞中可见空泡样改变然后传代后出现明显生长迟缓空泡增加，继而细胞崩解培养基是DMEM/F12：10%FBS冻存液是90%FBS+10%DMS

4、O支原体污染后的表现和肉眼可见特征即使细胞培养过程中支原体的浓度达到非常高的水平（大于108个支原体/ml），仍然没有任何明显可见的污染征兆培养基的颜色提前变化（pH值转变）倍增时间延长细胞形态改变细胞表层穿孔细胞周边不均匀空泡形成细胞结构降解对生长速度的不利影响支原体能够与细胞竞争营养物质，并分泌有害的代谢产物，从而对细胞增殖能有50%的抑制作用（有这篇文献为证McGarrityetal.,1984）葡萄糖快速降低，形成酸pH值转变精氨酸耗尽抑制蛋白质的生物合成，细胞分裂和细胞生长引起染色体畸变和多种易位（McGarrity

5、etal.,1978）基因芯片和基因表达谱产生显著的变化支原体能够占总蛋白的50%和纯化总DNA的15-30%他们甚至能够基本上控制宿主细胞所有的代谢功能在细胞培养中出现支原体污染以后的后果对生长速度的不利影响支原体能够与细胞竞争营养物质，并分泌有害的代谢产物，从而对细胞增殖能有50%的抑制作用（有这篇文献为证McGarrityetal.,1984）葡萄糖快速降低，形成酸pH值转变精氨酸耗尽抑制蛋白质的生物合成，细胞分裂和细胞生长引起染色体畸变和多种易位（McGarrityetal.,1978）基因芯片和基因表达谱产生显著的变

6、化支原体能够占总蛋白的50%和纯化总DNA的15-30%他们甚至能够基本上控制宿主细胞所有的代谢功能因此要进行支原体检测以便验证支原体的存在在细胞培养中出现支原体污染以后的后果支原体的检测DNA荧光染色（Bisbenzimid,DAPI）（图例）PCR技术（图例）一般以下情况需要进行支原体检测：新型的细胞和病毒培养物持续培养的细胞系每月进行检测；对实验室污染的情况下每周进行检测在每次液氮再次冻存之前对细胞特征进行改造修饰之后在无法得到重复的实验结果的情况下实验员察觉到了显著的支原体污染时！支原体的检测DNA荧光染色（Bisbenz

7、imid,DAPI）（图例）PCR技术（图例）（特异的引物设计来自高度保守的核糖体RNAs/16S-rRNA的DNA编码序列。在支原体中，保守的rRNA基因序列非常类似。这些引物不会检测到细菌或者动物的DNA序列）一般以下情况需要进行支原体检测：新型的细胞和病毒培养物持续培养的细胞系每月进行检测；对实验室污染的情况下每周进行检测在每次液氮再次冻存之前对细胞特征进行改造修饰之后在无法得到重复的实验结果的情况下实验员察觉到了显著的支原体污染时！被污染的细胞培养物或者病毒储液的处理立即隔离培养物（培养箱），并检测相应的冻存细胞样品通知所

8、有相关人员对实验室进行标准消毒对无法替代的，珍贵的细胞立即实施抢救高压灭菌/丢弃那些可以替代的细胞支原体清除的方法抗生素氟喹诺酮类衍生物环丙沙星(例如PromoKine的产品BIOMYC-3)支原体去除试剂（MRA）四环素类BIOMYC-1和2(P