原代细胞培养与建系

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1、原代细胞的培养与建系  细胞的来源多样，培养方法也各不相同，凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。原代细胞经分散接种之手段称为传代。凡能经传代方式进行再次培养的细胞称为传代细胞。若能稳定生长传至10~20代以上的细胞可确立为细胞系。若有条件能开展单细胞克隆、纯化，经大量扩增后所形成的生物学特性稳定的克隆化细胞群，称之为细胞株或克隆细胞。此过程称为细胞的纯化或细胞克隆。这些基本技术是从事细胞培养工作的基础，只有熟悉和掌握了基本技术,才可能更快捷地学习和掌握其他方法,本章重点叙述常

2、用的基本技术。  第一节 原代细胞的取材  人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，是进行细胞培养的第一步，若取材不当，将会直接影响细胞的体外培养，现将取材的基本要求和注意事项叙述如下：  一、取材的基本要求  （1）取材要注意新鲜和保鲜 新鲜组织易于培养成功，取材时应尽量在4~6h内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于4℃存放。若组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内4℃存放，但时间不能超过24h。对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含10%二甲基

3、亚砜的培养基，按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。  （2）取材应严格无菌 所取标本材料应在无菌条件下进行，为了确保无菌，对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高浓度抗菌素（400单位/mL）甚至加入适量的两性霉素B或10%达克宁液的培养液内于4℃下存放2小时以上，再用PBS洗2~3次，以确保所取材料无菌。要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少许培养液（内含400单位/mL抗菌素）的小瓶等便于携带的物品来取材，所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。  （3）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切

4、碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。  （4）要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。  （5）取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。  （6）原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。  二、各类组织的取材技术  (一) 皮肤和粘膜的取材 

5、 皮肤和粘膜是上皮细胞培养的重要组织来源，主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2~4cm2即可，这样局部不留疤痕，若对烧伤皮肤进行上皮细胞膜片移植，可从大腿或臀部取较大皮片，可取2~4cm2皮片，但取材时不要用碘酒消毒；若培养上皮细胞，取材时不要切取太厚，尽可能去除所携带的皮下或粘膜下组织；若欲培养成纤维细胞，则反之。皮肤粘膜与外界相通部位，因表面细菌、霉菌很多，取材时应严格消毒，必要时要用高浓度抗菌素和适量两性霉素B漂洗、浸泡。  (二)内脏和实体瘤的取材  内脏除消化道外基本是无菌的，但取材

6、时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织，否则培养后，由于成纤维细胞的生长给以后的培养工作增加困难。对于一些特殊细胞培养的取材，详见后面有关章节。  (三)血液细胞的取材  血液及淋巴组织中的血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝，通常采用肝素抗凝，常用肝素浓度为8~10u/mL血，抽血的针筒也要用肝素湿润，若从血站取来的献血员的血液，因血站不用肝素抗凝剂，常

7、用含枸椽酸盐抗凝，对此类血标本千万不能用含钙、镁离子的洗液来处理细胞，因此时的钙、镁离子可加速血液中凝血酶促进血液凝固而影响收获血细胞及淋巴细胞。此外要严格无菌，尽量新鲜使用。  (四)骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材  取上述标本时，除严格无菌，注意抗凝外，还要尽快分离培养，一般无需其他处理，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。具体操作详见后面有关章节。  (五)动物组织取材  1、鼠胚组织取材  首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟

8、后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力），取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，