原代细胞的培养和建系

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1、第四章原代细胞的培养和建系凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。凡是经传代方式进行再次培养的细胞称为传代细胞。若能稳定生长传至10-20代以上的细胞可确立为细胞系。单细胞经克隆、纯化并大量扩增所形成的特性稳定的细胞群体称为细胞株或克隆细胞。第一节原代细胞的取材人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，直接影响细胞的体外培养。一、取材的基本要求1．取材要注意新鲜和保鲜2．应严格无菌3．防止机械损伤4．去除无用组织和避免干燥5．注意组织类型、分化程度、年龄等6．作好记录二、各类组织的取材技术皮肤和粘膜的取材内脏和实体瘤的取材血液细胞的取材骨

2、髓、羊水、胸/腹水细胞取材动物组织取材人胚体组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材皮肤和粘膜的取材主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2~4平方厘米。内脏和实体瘤的取材内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。血液细胞的取材血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝。骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养

3、液洗一次后即可培养，不宜低温存放。动物组织取材1、鼠胚组织取材首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力），取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。2、幼鼠胚肾（或肺）取材幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉开至两侧：然后采用

4、无菌法打开胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先将背部毛皮切开游离并拉向两侧，然后采用无菌法从背部打开腹腔取肾。鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材步骤（1）取孵化至适当胚龄（9~12天）的胚蛋，暗处灯检，选取血管丰富、胚体有运动的胚蛋，用有色笔划出气室和胚体位置；（2）清洗蛋壳，再用碘酒、75%酒精消毒；（3）在无菌条件下采用无菌法用剪刀或中号镊子打开气室，沿气室边缘去除蛋壳；（4）用眼科镊撕去壳膜，暴露出鸡胚；（5）用弯头镊轻挑起胚头，取出胚胎，放入无菌平皿中，解剖取材。第二节原代细胞的分离和制作人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，必须将现有的组织块充分散

5、开，使细胞解离出来。一、悬浮细胞的分离方法组织材料若是来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟。经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。二、实体组织材料的分离方法对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。（一）机械分散法方法:特点:简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差，适用于处理纤维成分少的软组织。（二）消化分离法组织消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连

6、结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。酶消化分离法酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶胰蛋白酶（trypsin）分散原理：胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水解而使细胞分散开。影响胰蛋白酶作用的主要因素细胞类型酶的活力，活力通常在1：200、56°C、pH=8.0左右时最强酶的浓度温度pH无机盐离子，钙、镁等有抑制作用消化时间胶原酶（collagenase）消化法胶原酶是

7、一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用。消化分离法的操作步骤：消化分离法的操作步骤剪切加液漂洗消化弃去消化液漂洗机械分散消化分离法的注意事项（1）组织块必须漂洗2-3次以除去组织中的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。（2）胰蛋白酶浓度不宜过高，作用时间不能太长，以避免毒性作用。（3）消化后组织不仅要尽量弃