原代角质形成细胞的培养方法.doc

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1、原代角质形成细胞的培养方法角质形成细胞的原代培养方法作者：acne译来源：丁香园时间：2007-3-3实验仪器大全实验试剂大全细胞培养（CellCulture）专题:人角质形成细胞培养方法A.从新生儿包皮分离出表皮角质形成细胞1.在包皮环切术中，包皮放置于含冇庆大霉素（Cat.No.15710）（浓度为5ug/ml）的Dk-SFMZ屮。包皮可保存于2〜8。C直到需耍使用时。（注意：人类包皮可以保存于此种物质中2〜8。C约5天而不会明显失去细胞活性。）2.包皮放置于含有庆大霉素（浓度为20ug/ml

2、）的DPBS（不含Ca2+orMg2+）（Cat.No.14190）冲洗液屮约1小时。包皮剪成2〜4块并转移到酪蛋白溶解的25.0单位/ml的dispaseCCat.No.17105）DPBS溶液中（添加I5ug/ml的庆大霉素），在2〜8。C条件下孵育18小时。3.dispase孵育后，人角质形成细胞的表皮层从真皮层分离下来，转移到加有5〜10ml0.05%胰蛋白酶-0.53mMEDTA（Cat.No.25300）的60mm有盖培养皿中。在36°C±2°C条件下孵育大约15分钟，在这个过程中，每

3、2〜3分钟使用2ml的移液管吹打以帮助细胞解离。1.孵育以后，胰蛋白酶活性使用10ml大豆胰蛋白酶抑制剂(Cat.No.17075)终止,大豆胰酶抑制剂终浓度为10mg/ml使用DPBS(不含Ca2+orMg2+)配置，并在使用前无菌过滤。细胞悬液转移到15ml无菌离心管，在室温下40g离心5分钟。细胞重新制成悬液并按上述方法再次离心。2.角质形成细胞使用5ml完全培养基轻柔的吹打成悬液，并使用血细胞计数器计算角质形成细胞浓度。原代细胞大约3X106放入75cm2组织培养瓶中，并加入15ml完全培

4、养基。细胞培养：松弛的瓶盖，36°C±2°C,5%CO2的潮湿空气中。3.角质形成细胞培养液约每2〜3天更换一次。4.由于原代角质形成细胞在供者之间生长特性的差异性，原代培养可能需要6-10天才能达到60%〜75%的融合。B.人表皮角质形成细胞的传代1.达到60%〜75%的融合后，移去培养基，单层细胞使用10ml1：5000乙二胺四乙酸(Versene)冲洗。［〜2ml0.05%胰蛋白酶-0.53mMEDTA加入培养瓶中在36°C±2°C孵育5J0分钟。当细胞开始变圆时，移除胰蛋白酶，在36°C±

5、2°C再次孵育。2.当大约90%细胞分离时，使用10ml大豆胰蛋白酶抑制剂终止胰蛋白酶活性。细胞悬液转移到15ml无菌离心管，在室温下40百离心5分钟。细胞重新制成悬液并按上述方法再次离心。3.角质形成细胞使用3~5ml完全培养基轻柔的吹打成悬液，细胞大约1〜3X106放入75cm2组织培养瓶中，并加入15ml完全培养基。1.细胞培养：36°C±2°C,5%C02的空气中。角质形成细胞培养液约每2〜3天更换一次，当达到60%〜75%融合后，即可进行传代。