猪输血传播病毒I型和II型双重PCR方法的建立及应用.pdf

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1、目录一、摘要中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3二、英文缩略语⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6三、论文前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7实验材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯16讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯30结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33四、本研究创新性的自我评价⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34五、参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35六、附录综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯38在学期间科研成绩⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯50致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52·中文论著摘要·猪输血传播病毒Ⅰ型和Ⅱ型双重PCR方法

3、的建立及应用目的针对猪输血传播病毒（PTTV）Ⅰ型和Ⅱ型全基因保守序列，设计2对特异性引物，建立双重PCR方法并对辽宁地区猪群进行感染情况调查，同时对全基因序列进行遗传变异分析，该结果为辽宁地区PTTV分子流行病学研究提供一定的理论依据。方法参照GenBank中PTTVI型(GU570202)和PTTVII型（AY823991）的全基因序列，应用Oligo7.0设计了两对特异性引物，在单重PCR的基础上，建立双重PCR检测方法，即同时区别PTTVI和PTTVII两种基因型的感染，并对双重PCR反应条

4、件进行优化，通过特异性、敏感性和重复性试验验证该方法的准确性。利用所建立的PTTV双重PCR检测方法对辽宁地区14个市采集的血液样品进行检测，明确辽宁地区PTTV感染情况。采用PCR分段扩增PTTVI型和PTTVII型的全基因组，将PCR产物分别进行克隆测序，利用DNAMAN6.0软件进行拼接获得全基因组序列，然后用DNAStar7.1（ByJotunHeinMethod）软件将其与国内外分离毒株的基因序列进行同源性比对分析，用MEGA软件中(Neighbor-joiningmethod)构建系统进

5、化树，分析辽宁毒株的遗传变异特点。结果1、针对PTTVI型和PTTVII型保守基因序列，用Oligo7.0软件设计2对特异性引物，建立了双重PCR检测方法，该方法可以特异性扩增出PTTV2种不1同毒株的目的基因，片段大小差异在100bp以上便于电泳观察，重组质粒标准品检测下限为1.0×105拷贝。2、用建立的双重PCR方法对501份健康猪和非健康猪的血液样品进行检测，结果表明健康猪PTTVI与PTTVII感染率分别为36.44%和60.16%；PTTVI和PTTVII混合感染率为21.46%；非健康

6、猪PTTVI与PTTVII感染率分别为39.76%和63.94%，PTTVI和PTTVII混合感染率为29.25%。3、辽宁毒株TTV1-LNJZ和TTV2-LNSY基因全长分别为2894bp和2804bp，GenBank登陆号分别为KT968712、KU156681，两个基因型均有4个开放阅读框（ORFs），与国内外20个PTTVI型毒株进行比较，其同源性为58.5%～96.4%，与国内外20个PTTVII型毒株进行比较，其同源性为70.5%～96.7%。结论1、本研究成功构建了PTTV双重PCR

7、检测方法，该方法具有快速、准确、敏感等优点。2、辽宁地区PTTVI型和PTTVII型均有感染，并且感染率较高，健康猪和非健康猪PTTVI型感染率分别为36.44%和39.76%；健康猪和非健康猪PTTVII型感染率分别为60.16%和63.94%。3、辽宁毒株TTV1-LNJZ和TTV2-LNSY全基因序列与国内外毒株的同源性分别为58.5%～96.4%、70.5%～96.7%。其中TTV1-LNJZ毒株与1p毒株（AY823990.1）遗传进化关系最近；TTV2-LNSY毒株与TTV2XYF7毒株

8、（JX535334.1）遗传进化关系最近。关键词猪输血传播病毒；双重PCR；方法建立；感染情况调查；遗传变异分析2·英文论著摘要·EstablishmentandapplicationofdoublePCRwithPorcinetorquetenovirusⅠandⅡObjectiveWedesigned2pairsofspecificprimersaccordingtocompleteconservativegenomesequencesandestablished