《细胞培养方法》PPT课件

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1、细胞培养理论课：第一部分细胞培养基本知识李松第二部分细胞培养室的设置、细胞培养用液李松第三部分细胞培养的基本技术卿晨博士第四部分正常组织细胞的培养李松第五部分肿瘤细胞培养杨继红博士第六部分组织培养技术和应用卿晨博士杨继红博士实验部分：参观实验室培养细胞的观察培养细胞生长曲线的绘制第一章细胞培养基本知识组织培养工作始于本世纪之初（Harrison1907,Carrel1912）组织培养、细胞培养、器官培养组织细胞培养的主要优点：（1）研究的对象是活的细胞；（2）研究的条件可控制；（3）研究的样本可以达到均一

2、性；（4）研究的内容便于观察、检测；（5）研究的范围比较广泛；（6）研究的费用相对较经济。细胞培养存在的不足：（1）组织或细胞与体内相应者仍然存在差异；（2）细胞培养存在一定的不稳定性也是其缺点之一；（3）细胞培养对人员、设备等条件都要求较高。研究的内容：（1）细胞与细胞之间的相互作用。（2）细胞内部与细胞外界之间的作用。（3）细胞内胞质的活动。（4）胞质与胞核之间流动。应用领域：1．病毒学利用培养的细胞可获得大量病毒以产生疫苗及鉴定。2．免疫学杂交瘤一单克隆抗体技术。3．遗传学可以利用细胞培养技术进行染

3、色体分析。细胞遗传学。4．肿瘤学细胞培养技术已广泛应用于肿瘤的研究和治疗。5．分化及发育6．细胞毒试验7．临床医学及生物技术方面的应用一、培养细胞的特性（一）、培养细胞的生长方式及类型1．贴附生长型细胞：上皮细胞型：其生长特点为细胞之间紧密相靠、互相衔接，具有连接成片能力。成纤维细胞型：其生长特点为细胞一般并不紧靠相连成片，而是排列为漩涡状、放射状。2.悬浮生长型细胞：不需要附着于底物即可生长，肿瘤细胞及部分正常细胞（二）、培养细胞的生长特点1．贴附细胞接种后5~10min可见细胞以伪足初期附着，接着细胞

4、逐渐伸展开，细胞体的中心部分亦随之变为扁平。2．接触抑制及密度依赖性细胞生长汇合成一片时，其分裂增殖停止，这种生长特性即为密度依赖性调节。转化细胞或癌瘤细胞则接触抑制下降，他们互相之间可在上面或下面经过而重叠生长。（三）、培养细胞的生长过程1．单个细胞的生长过程：细胞周期细胞周期=间期+M期=G1期+S期+G2期+M期G1期：DNA合成前期，为下一步DNA复制和蛋白质合成作准备。S期：DNA合成期。本期的细胞活动主要为DNA的合成。G2期：DNA合成后期。M期：有丝分裂期。2．细胞系（cellline）的

5、生长过程：原代培养（primaryculture）：传代期（subculture）：衰退期：3．每代细胞的生长过程滞留期：一般细胞滞留期约为24~96h。指数生长期：此期细胞增殖旺盛，成倍增长，适用于进行实验研究。持续3~5d。平台期：二、培养细胞生长的条件（一）、细胞的营养需要1．基本营养物质:包括氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子。2．促生长因子：血清中含有多种上述细胞生长所需的物质。3．其它条件:温度：需在保持一定恒温，适宜的温度与取材的动物种类有关。高温比低温对细胞的影响细胞更为明显。气相：多数

6、细胞需要有O2条件下才能生长，氧张力通常维持在略低于大气状态，体外培养细胞其气体环境一般应为95%空气加CO2的混合气体。pH：适于在pH7.2~7.4条件下生长，一般来说，偏酸的条件比偏碱的环境对生长有利。渗透压：人类血浆的渗透压约为290mmol/L，多数培养细胞对渗透压有一定范围的耐受能力。无污染及无毒：微生物的污染、不同细胞类型的交叉污染。第二章细胞培养室的设置和准备工作一、细胞培养实验室的设置及设备（一）、细胞培养实验室的设置细胞培养实验室应能进行：无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏

7、。1．无菌操作区（1）无菌操作室（2）净化工作台侧流式或称为垂直式；外流式或称为水平层流式。（3）无菌操作箱2．孵育区3．制备区：进行培养液及有关培养用液等的制备。4．储藏区5．清洗和消毒灭菌区（二）、细胞培养实验室设备1．常用的基本设备（1）显微镜：倒置显微镜（2）培养箱：恒温培养箱及CO2培养箱（3）干燥箱：（4）水纯化装置：培养液及试剂等均需使用三次蒸馏水。（5）冰箱：（6）细胞冷冻储存器：（7）离心机：（8）消毒器：（9）滤器：（10）各类培养用器皿：培养器皿、培养瓶、多孔培养板、吸管、加样器等。

8、2．特殊设备:酶联免疫检测仪、超低温冰箱、流式细胞仪等。二、培养用品的清洗和消毒灭菌（一）、培养用品的清洗1．清洗（1）浸泡：在5%稀盐酸溶液中浸泡过夜，以中和其碱性物质。（2）刷洗：（3）清洁液浸泡：由浓硫酸、重铬酸钾及蒸馏水配制而成，浸泡6h以上。2.冲洗（二）、培养用品的消毒灭菌1．消毒灭菌的方法（1）干热消毒（2）湿热消毒（3）紫外线消毒：（4）过滤除菌消毒：血清、合成培养液、酶及含有蛋白质具有生物活性的液体等。微孔滤