《细胞培养》PPT课件

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1、细胞培养部分计划0，细胞培养准备工作1，鸡胚原代细胞培养及观察，细胞计数。2，两天后作细胞传代细胞培养的优点1.活细胞：能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生命活动2.可控制：可控制-选择对象：均一性、重复性可控制-调节条件：物理、化学、生物等因素可控制-利用方法：采用各种研究技术、记录方法：研究：倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记,记录：摄影照片、缩时电影3.应用广：对象广：各种动物：低等动物--高等动物--人类,不同组织4.较经济：提供大量、同时、重复性好的、生物学性状相似的实验对象细胞培养的缺点

2、人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同.当细胞被置于体外培养后,生活在缺乏动态平衡的环境中,久了，必然发生变化.1.与体内主要不同相对孤立、相对单一缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响2.主要表现失去原有组织结构和细胞形态分化减弱或不显,细胞趋向单一化；3.要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。体外细胞培养物的生长类型按生长方式分成黏附型和悬浮型两种粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。绝大多数有机体细胞属粘附型细胞，只有少数细胞类，如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬

3、浮状态下生长。细胞在体内、外的粘附方式存在差异体内：粘附是全方位，立体的体外：多数情况，细胞只有一个附着平面根据形态大致的不同，主要分上皮样成纤维细胞样其它，不定型体外培养细胞的形态分类上皮样细胞型形态：类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形，中有圆形核。来源：表皮及其衍生物，乳腺：外胚层消化道，呼吸道上皮内胚层内皮中胚层上皮性肿瘤与体内上皮区别：体内：单层扁平，单层立方，单层柱状，假复层柱状纤毛，变移，复层扁平。体外：一种，不再区分。生长特点易相连成片，铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动成纤维细胞样细胞培养中形态与成纤维细胞类似的形态：胞体梭形或不规则三角形，胞质向

4、外伸出2—3个长短不等的突起，中有卵圆形核。来源：成纤维细胞，平滑肌：中胚层生长特点排列成放射状，漩涡状并不紧靠连成片，细胞—细胞接触易断开而单独行动游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起培养细胞的形态不稳定，条件改变，细胞形态可有变化。血清Hela高血清低血清成纤维细胞样上皮样细胞pHHela太酸或太碱标准pH成纤维细胞样上皮样细胞细胞密度3T3低密度高密度成纤维细胞样上皮样细胞生长状态改变悬浮或贴附悬浮贴附圆形成纤维或上皮样转化与否未转化转化后成纤维样可成上皮样悬浮生长型概念培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长来源自血，脾或骨髓，尤以血

5、中白细胞癌肿细胞也可能特点在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团优点生存空间大，提供数量大传代方便(不需消化)易于收获可获得稳定状态缺点观察不方便很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)细胞计数用70%酒精清洁血红细胞计数板和盖玻片，镜头纸擦干；取20μl细胞悬浮液小心地从盖玻片的边缘加入血红细胞计数板的两个室，通过毛细管作用，细胞悬浮液在血红细胞计数板和盖玻片之间均匀地分布；切勿加入过量，只要充满即可。置入显微镜，用10倍的目镜和10倍的物镜观察细胞，统计其中四个大的方阵中的细胞数，如果细胞浓度太高，可稀释再统计，记住稀释的倍数；细胞浓度=（四个方阵中细胞数之和/4）X104/ml，

6、方阵上方和左边边缘的细胞可统计在内，但下方和右边边缘的细胞则不应统计，如有细胞团计为一个。用70%酒精和蒸馏水清洁血红细胞计数板和盖玻片，镜头纸擦干。血红细胞计数板(hemocytometer)含有两个室，每个室被划分为9个方阵，其中4个方阵有16个小方格，为0.1mm3或1x10–4ml，细胞浓度取决于已知体积中的细胞数。0.4%trypan鉴定细胞死活。而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。细胞的冻存-准备好冻存细胞所需的液氮罐及液氮，细胞冻存管并写好标签：细胞名称，时间及保存人；取对数生长期的细胞(2-5x105cells/ml)，收集细胞前24h换液一次；吸出培养液，

7、用PBS洗细胞一次，除去，加入1mlTrypsin-EDTA,放入37℃保温3-5min,使细胞脱离底部；离心细胞并重悬浮于10%DMSO/90%FCS中，大约1-5x106cells/ml；每个冻存管中加入1ml细胞悬浮液，拧紧盖子。冷冻细胞应缓慢降温，可用装有异丙醇的冷冻盒(每两个小时温度下降10℃)，放入-20℃冰箱中过夜，第二天再转至-80℃冰箱，可保存数月，如需长期保存，应转至液氮中。细胞解冻复苏在37℃水浴中预热培养基；将冻存的细胞从液氮中取出