《细胞培养培训》ppt课件

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1、细胞培养培训2009-6-12常用设备液氮罐、储品柜(存放杂物)、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱(-80℃)、空调、二氧化碳缸瓶、边台(书写实验记录)。离心机(收集细胞)、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱、水浴锅、4℃冰箱无菌室的灭菌1.定期打扫无菌室:每周打扫一次,先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等,然后用3‰来苏水或者新洁尔灭或者0.5%过氧乙酸擦拭。2.CO2孵箱(培养箱)灭菌:先用3‰新洁尔灭擦拭,然后用75%酒精擦拭或者0.5%过氧乙酸,再用紫外灯照射无菌室的灭菌3.实验前灭菌:打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系

2、统各20-30分钟4.实验后灭菌:用75%酒精(3‰新洁尔灭)擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。实验人员的无菌准备1.肥皂洗手。2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩。3.用75%酒精棉球擦净双手。无菌操作的演示1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基的瓶子均要用75%酒精擦拭瓶子的外表面2.靠近酒精灯火焰操作。3.器皿使用前必须过火灭菌无菌操作的演示4.继续使用的器皿(如瓶盖、滴管)要放在高处,使用时仍要过火。5.各种操作要靠近酒精灯,动作要轻、准确,不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管,防止交叉

3、污染。细胞培养用液的配制与消毒细胞培养用水必须非常纯净,不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水青、链霉素溶液的配制与消毒1.    所用纯净水(双蒸水)需要15磅高压20分钟灭菌。2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶,用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶,加5ml灭菌双蒸水,即每毫升各为20万单位。3.使用时溶入培养液中,使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位=1微克?RPMI1640的制备与消毒1.溶解、调PH值、定容:先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲

4、洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml,使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。最后定容至1000ml,摇匀。RPMI1640的制备与消毒2.安装蔡式滤器:安装时先装好支架,按规定放好滤膜,用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。3.抽滤:配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。4.分装:将过滤好的培养液分装入小瓶内置于

5、4℃冰箱内待用。5.使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液(4℃时两周有效)。血清的灭活细胞培养常用的是小牛血清,新买来的血清要在56℃水浴中灭火30分钟后,再经过过滤方可加入培养基中使用。谷氨酰胺合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺,其作用非常重要,细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质,谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,4℃下放置1周可分解50%,故应单独配制,置于-20℃冰箱中保存,用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时,应

6、重新加入原来的谷氨酰胺。谷氨酰胺一般培养液中谷氨酰胺的含量为1~4mol/L。可以配制200mol/L谷氨酰胺液贮存,用时加入培养液。配制方法为,谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mol/L的溶液,充分搅拌溶解后,过滤除菌,分装小瓶,-20℃保存,使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。细胞传代培养(消化法)一.  传代前准备:1.预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。2.用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。3.正确摆放使用的器械:保证足够的

7、操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。4.点燃酒精灯:注意火焰不能太小。细胞传代培养(消化法)5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶,放入微波炉内高火,8分钟再次消毒。6.取出预热好的培养用液:取出已经预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。7.从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观察细胞。8.打开瓶口:将各瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口消毒。细胞传代培养(消化法)吹打分散细胞1.吹打制悬:用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。2.吸细胞悬液入离心管:将细胞悬液吸入10ml离心管

8、中。3.平衡离心:平衡后将离心管放入台式离心机中,以1000转/分钟离心6-8分钟。4.弃上清液,加入新培养液:弃去上清液,加入2ml培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。细胞传代培养(消化

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