细胞培养的基本方法ppt课件.ppt

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1、细胞培养的基本方法细胞培养的基本概念2细胞培养是指从体内组织取出细胞在体外模拟体内环境下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一一种培养技术。细胞培养的培养物可以是单个细胞，也可以是细胞群。细胞培养的目的与用途2一、基础研究(1)药物作用机理(2)基因功能(3)疾病发生机理二、科学研究:(1)新药筛选:如药效研究,中药有效成分筛选等.(2)疫苗研究与开发:如肝炎疫苗,艾滋病疫苗，肿瘤疫苗等.(3)基因工程药物与细胞工程药物的研究与开发(4)单克隆抗体制备细胞培养主要的设施器材2设施：超净台、恒温培养箱、倒置显微镜、液氮储存罐、冰柜、恒温

2、水浴槽、离心机、压力蒸汽消毒器。器材：一、玻璃器材玻璃培养皿、刻度吸管、离心管、培养瓶等，（现已较少使用）。二、塑料器材多孔培养板（6,12,24,48,96）、培养皿、培养瓶、离心管、冻存管。三、橡皮器材橡皮制品（最好是硅制品）做各种瓶或试管的塞子、盖子。四、金属器材剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头五、其他物品纱布、注射器、针头、滤头细胞培养的条件（1）适宜的温度和PH37℃，pH7.2~7.4。（2）气体环境95%空气+5%CO2;适宜的湿度（无菌水不能干掉）。（CO2：细胞生长所必需的成分,pH值

3、维持，最低不能低于1%。）（3）营养物质N源、C源、无机盐、维生素、H2O，细胞培养基中含有。常用的细胞培养基：DMEM，RPMI-1640，BME，M199等。（4）无菌条件紫外消毒、空气过滤、无菌滤头，高压灭菌、严格操作。设施、器材、试剂实物图培养细胞的分类按照是否贴壁：贴壁细胞：大多数属此类细胞，如肿瘤细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、神经胶质细胞等。悬浮细胞：主要为取自血、骨髓、脾的细胞，如白血病细胞。按照传代次数：原代细胞：即从体内取出组织接种培养而未经传代的细胞。（也有人把传代10次之内的细胞统称为原代细胞。）细胞系：指原代细

4、胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。如HeLa细胞、CHO细胞等。原代培养原理：将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。原代培养方法：消化培养法、组织块培养法。原代消化培养法（1）处理组织：用Hanks液漂洗组织2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。（2）剪切：将组织切成2~3毫米大小的块，加入胰蛋白酶液，然后一并倒入培养皿中。（3）消化：置于37℃温箱消化，每

5、隔20分钟摇动一次。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。（4）分离：用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心收集细胞，弃上清。（5）加入适量培养基重悬细胞，分装入培养瓶中，补足培养基。（6）培养：置于37℃，5%CO2温箱培养。原代组织块培养法（1）剪切：用Hanks液漂洗二三次以去掉组织块表面血污，剪成1mm3小块。（2）摆布：将组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆

6、布20~30块。（3）轻轻翻转培养瓶，令瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，盖好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。（4）培养：从微箱中取出培养瓶，46度斜持培养瓶，向瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶底上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。细胞的传代细胞传代的概念：随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此

7、时就需要将原有细胞分成几部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养，这个过程就称为传代（passage）。传代方法：悬浮细胞传代、贴壁细胞传代。细胞的传代悬浮细胞传代：（1）收集细胞悬液；（2）离心（1000转/分，2分钟）；（3）弃上清；（4）加入新鲜培养基重悬细胞；（5）按照适当比例接种到新的培养皿；（6）补足培养基；（7）放于温箱培养。重悬分装放入温箱细胞的传代贴壁细胞的传代：（1）吸去陈旧培养基，并用PBS清洗细胞表面；（2）加入胰酶消化细胞；（3）加入新鲜培养基终止胰酶消化；（4）将细胞吹打下来，收集，离心；（5）弃

8、上清；（6）加入新鲜培养基重悬细胞；（7）按照适当比例接种到新的培养皿；（8）补足培养基；（9）放于温箱培养。终止胰酶消化并吹打重悬分装放入温箱吸去旧培养基，PBS清洗加入胰酶消化细胞的换液悬浮细胞换液：收集细胞悬液、离